Sema4D/PlexinB1通过调控周细胞PDGF-Shh信号促进脑梗死后新生血管稳定和管壁肌化

The stability and maturity of vascular structures following angiogenesis after cerebral infarction is very important for the long-term prognosis. We found that effective blood perfusion resulting from spontaneous angiogenesis maturation, which may be closely related with the dysfunction of pericytes regulated by Sema4D/Plexin-B1 and PDGF-Shh signal transduction. This project aims to explore the dynamic change in Sema4D/Plexin-B1 and PDGF - Shh signals and mechanism of migration, adhesion and transformation of pericytes controlled by Sema4D/Plexin-B1 and PDGF - Shh, using knockout mice, MR perfusion weighted imaging, fluorescence tracerand so on , both In vivo and In vitro conditions. We also detected that, during ischemic insults, neurons could highly express Sema4D, which induced pericytes attached to the tube to form a stable new lumen by PDGF-Shh-Ang-1/Tie-2, as well as promoted pericytes transformation and strengthened vascular contraction by PDGF-Shh-Gli-1/α-SMA. Our study is to explore Sema4D as a potential therapeutic target to induce angiogenesis forming mature vascular and provide effective blood perfusion after stroke.

脑梗死后新生血管稳定、成熟对患者长期预后至关重要。我们发现：大鼠脑梗死区域自发性新生血管无法形成成熟管腔，提供有效血流灌注，与Sema4D/Plexin-B1和 PDGF-Shh信号调控周细胞活动密切相关。本项目拟在In vivo 和 In vitro 情况下，采用基因敲除小鼠、磁共振灌注显像、荧光示踪等多种试验方法，探讨脑梗死后Sema4D/Plexin-B1和 PDGF-Shh信号动态变化规律，确定其与周细胞迁移、贴附和转化的调控关系，讨论脑梗死后，缺血缺氧诱导神经元高表达Sema4D调控PDGF激活周细胞Shh-Ang-1/Tie-2信号途径诱导周细胞贴壁、稳定新生管腔；激活Shh-Gli1-α-SMA信号途径促进周细胞转化、管壁肌化，加强血管收缩功能的具体分子机制。探讨以Sema4D为治疗靶点，诱导脑梗死后新生血管成熟和管壁肌化，最终重建血运、改善预后，为脑梗死治疗提供新线索。

脑梗死后的炎症反应过程与血脑屏障完整性密切相关，以往的研究表明Sema4D在中枢神经系统疾病中可诱导炎性小胶质细胞激活并破坏内皮功能。本研究首次发现Sema4D通过其受体PlexinB1对脑梗死后血管周围炎症及血脑屏障破坏的起到至关重要作用，为治疗脑梗死后脑水肿提供新靶点。本研究采用成年雄性大鼠建立短暂性大脑中动脉闭塞模型。tMCAO术前5天对大鼠行脑区定向注射介导CRISPR/Cas9基因干扰PlexinB1的慢病毒，通过增强磁共振、伊文思蓝评估梗死侧的血脑屏障破坏水平，纤维蛋白沉积免疫荧光染色确定脑梗死后血管周围渗出情况。糖氧剥夺/复氧模型用来模拟体外缺血条件，通过建立体外血脑屏障模型以及TEER实验来研究Sema4D/PlexinB1信号对血脑屏障通透性及内皮紧密连接的影响。采用免疫荧光、 Western Blot、 RT-PCR、流式细胞学分析观察体内体外相关信号分子的蛋白及mRNA的表达水平以及细胞定位。我们发现在tMCAO后Sema4D表达水平与血脑屏障通透性同步增加，同时分泌型Sema4D在缺血侧的血管周区域大量积聚。 抑制Sema4D/PlexinB1信号通路可显著降低血脑屏障通透性，从而改善脑梗死预后。在体外水平，我们证实外源性Sema4D通过与周细胞上的PlexinB1受体结合诱导内皮细胞紧密连接破坏，最终破坏血脑屏障完整性。在机制水平上，我们证实Sema4D可诱导周细胞获得CD11b阳性免疫表型以及表达促炎细胞因子。 进一步地，我们发现外源性Sema4D通过抑制AUF1诱导的mRNA衰变效应，促进周细胞促炎因子的上调。综上所述，脑梗死后Sema4D被星形胶质细胞大量分泌，并通过与周细胞上的PlexinB1受体结合，促进血管周炎症反应，破坏血脑屏障的完整性。我们的研究提示Sema4D可能是脑梗死急性期抑制脑水肿的治疗新靶点。