ATG14介导自噬体-溶酶体融合在氟致神经毒性中的作用及机制

The neurotoxicity caused by excessive fluoride exposure has drawn much attention, but its specific mechanism has not been elucidated. Recent studies have shown that the autophagic flux blockage plays an important role in nervous system injury, and autophagosome-lysosome fusion is the basis of autophagic flux. Our previous study found that excessive fluoride exposure induced autophagic flux blockage in the hippocampus of SD rats and the human neuroblastoma SH-SY5Y cells, leading to cell death. Furthermore, our preliminary experiments showed that fluoride exposure induced autophagosome-lysosome fusion dysfunction and decreased ATG14 expression in SH-SY5Y cells. Since ATG14 is the key switch of regulating the autophagosome-lysosome fusion core factor STX17-SNAP29-VAMP8 complex, we thus speculating that fluoride may cause autophagosome-lysosome fusion dysfunction by affecting ATG14 function, causing autophagic flux blockage, leading to neurotoxicity. Therefore, this project intends to establish the ATG14 gene knockdown and over-expression models of animal and cell, using Western blot, immunofluorescence, co-immunoprecipitation and other methods to explore the role of ATG14 and autophagosome-lysosome fusion dysfunction in neurotoxicity caused by fluoride, and reveal its internal relations, to further clarify the molecular mechanism of fluoride-induced neurotoxicity, thus providing a scientific basis for the prevention and control of fluoride-induced neurotoxicity.

过量氟暴露致神经毒性已引起高度关注，但其机制尚未阐明。目前研究显示，自噬流阻滞在神经系统损伤中发挥重要作用，自噬体-溶酶体融合是自噬流通畅的基础。我们前期研究发现，氟可致SD大鼠海马及人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y自噬流阻滞，引起细胞死亡，且我们预实验发现，氟可致SH-SY5Y细胞自噬体-溶酶体融合受阻及ATG14表达下降。因ATG14是调控自噬体-溶酶体融合核心因子STX17-SNAP29-VAMP8复合物的关键开关，据此推测氟可能通过影响ATG14功能而导致自噬体-溶酶体融合受阻，引起自噬流阻滞而产生神经毒性。因此，本项目拟通过建立ATG14基因敲减及过表达的动物及细胞模型，采用Western blot、免疫荧光、免疫共沉淀等方法，探究ATG14和自噬体-溶酶体融合受阻在氟致神经毒性中的作用，并揭示其内在联系，进一步阐明氟致神经毒性的分子机制，为氟致神经毒性的预防与控制提供科学依据。

地方性氟中毒是持续威胁我国人民健康的主要地方病之一，其神经系统损伤已引起广泛关注，但其具体作用机制目前仍不清楚。本项目通过构建发育期低剂量氟化钠（Sodium Fluoride，NaF）暴露动物及氟化钠染毒神经细胞模型，探讨ATG14介导的自噬体-溶酶体融合异常在NaF致神经毒性中的作用及机制，为探索氟致神经毒性的机制提供科学依据。在体内研究中，我们通过自由饮水的方式建立了自亲代怀孕至子代2月龄的NaF饮水型染毒模型，模拟饮水型氟病区人群的实际暴露状况。结果发现，NaF暴露可导致子代成年大鼠学习记忆能力及记忆保持能力下降，神经元合成蛋白质能力下降。同时，NaF暴露引起海马组织凋亡水平升高，此外，NaF暴露引起海马组织自噬降解受阻和自噬体-溶酶体融合障碍。在体外研究中，我们用浓度的NaF处理人神经母细胞瘤细胞（SH-SY5Y），观察到随着NaF染毒剂量的增加，SH-SY5Y细胞存活率下降，而凋亡率上升，自噬功能障碍、自噬体-溶酶体融合异常，并抑制ATG14与融合蛋白质STX17-SNAP29-VAMP8复合物之间的相互作用。通过自噬激动剂雷帕霉素及ATG14过表达腺病毒对NaF染毒组干预后发现，雷帕霉素及ATG14过表达腺病毒可通过加强ATG14与STX17-SNAP29-VAMP8复合物之间的相互作用促进自噬体-溶酶体融合，改善自噬流，提高细胞存活率，降低细胞凋亡率，进而减轻NaF诱导的神经毒性。通过以上研究阐明了ATG14和自噬体-溶酶体融合受阻在氟致神经毒性中的作用及分子机制，为氟致神经毒性的预防与控制提供了新的线索与参考。