自噬在职业锰暴露致心脏毒性中的作用及机制研究

It is widely known that manganese is a neurotoxic metal in the past years, and it is harmful for those workers with occupational exposure. However, our previous research results showed that manganese also could cause cardiac injury for workers and rats, and the myocardial cell autophagy was inhibited, but the dose-response relationship and molecular toxicity mechanism need be explored. Our scientific hypothesis includes that manganese causes the mitochondria damage of myocardial cell, but the cell autophagy is inhibited at the same time, and so the damaged mitochondria can not be effectiely cleared by autophagy, and finally it will cause the dyfunction or death of myocardial cell. Firstly, based on the manganese exposure worker cohort, we will explore the dose-response relationship between the manganese exposure and cardiac function damages. Secondly, we will carry out the animal experiment, and detect the changes of myocardial structures and function, especially, the mitochondria damage. We will illuminate the dose-response of chronic manganese exposure and myocardial impairment in rats, and the inhibited effects of autophagy caused by manganese. At last, we will carry out the cell research, and detect the mitochondria damage, cell viability, apoptosis, autophagy proteins in different stages and the changes of autophagy flow after manganese exposure. Moreover, we will use the autophage stimulator rapamycin, inhibitor 3-MA, and knock-out of Atg7 gene, and systematically identify the cardiac toxicity of manganese and the function and related mechanisms of autophagy during the toxicity. Our study will provide key theoretical evidences for prevention and treatment of cardiac toxicity caused by manganese pollution.

金属锰作为一种神经毒性物质已被广泛认可，可对职业接触工人的健康产生损害。但课题组前期研究结果显示锰暴露的工人心电图异常、大鼠心脏受到损伤、以及H9c2心肌细胞自噬被抑制，提示锰可能具有心脏毒性作用，但其剂量-效应关系及分子毒理机制有待研究。本项目科学假说为：金属锰对心肌细胞线粒体产生损伤，但此时细胞自噬被抑制不能有效清除损伤的线粒体，导致细胞毒作用。我们首先采用流行病学研究，探讨工人不同锰暴露剂量与心脏功能损伤的剂量-效应关系；其次采用动物实验研究，探讨大鼠慢性锰染毒后心脏结构及功能改变、细胞线粒体损伤、以及心肌细胞自噬变化；最后采用细胞机制研究，检测染锰后H9c2细胞线粒体损伤、细胞活力与凋亡、以及自噬各阶段标志性蛋白与自噬流的变化，并分别采用自噬激活剂、抑制剂、以及敲除自噬关键基因Atg7，系统阐明金属锰的心脏毒性及自噬在其中的作用机制。从而为金属锰的心脏毒性防治提供科学依据。

本项目通过职业流行病学研究探讨金属锰暴露对血清心肌酶和心电图的影响，并采用大鼠慢性锰暴露实验和H9c2细胞染锰实验，深入研究自噬在锰致心脏毒性中的作用和机制。基于广西职业锰暴露工人队列，首先采用横断面研究设计，根据锰外暴露水平将纳入的744名工人分为低暴露组和高暴露组，采用多因素logistic回归模型分析Mn-TWA对工人血清心肌酶水平的影响。职业锰暴露与工人肌酸激酶及其同工酶升高的风险增加有关（P＜0.01；P＜0.05），分层分析发现，特别是在工龄>19年、男性工人、目前吸烟和饮酒的工人中，Mn-TWA水平与CK升高风险更为显著。其次，采用前瞻性队列研究设计，根据血细胞锰浓度，将纳入的325名工人分为低、中、高暴露组，采用Cox比例风险回归模型分析血细胞锰水平与心电图异常的关联。采用多元线性回归模型分析锰浓度与心电图各项指标纵向变化的关联。锰暴露与异常心电图发生风险不存在显著关联（HR = 0.89, 95%CI: 0.51, 1.55, P = 0.89），但血细胞锰浓度与PR间期的变化有显著性关联（β = 6.32, 95%CI: 1.92, 10.73, P = 0.005）。体内实验，40只雄性SD大鼠随机分为4组，分别腹腔注射生理盐水、5、10和20 mg/kg锰溶液24周，Western blot检测结果显示，大鼠心肌细胞凋亡蛋白表达水平升高，自噬和PI3K/Akt信号通路被激活。体外实验，对H9c2细胞进行体外锰染毒，结果显示锰暴露可引起氧化应激水平升高，线粒体结构与功能损伤，细胞凋亡，并通过抑制mTOR信号通路，启动介导自噬形成的泛素样结合系统，激活自噬，并且自噬在锰致心肌细胞毒性中发挥保护作用。其次，锰暴露还可以激活PI3K/Akt信号通路，并且该通路在锰致心脏毒性中也发挥保护作用。综上，本项目通过职业人群流行病学、动物实验及细胞毒理学机制实验三方面的研究，系统地评价了金属锰暴露对心脏功能的损害效应及自噬在锰致心脏毒性过程中的作用机制，为金属锰的心脏毒性防治提供了科学依据。