GADD153/TRB3/AKT/Bad通路参与调控磨损颗粒诱导巨噬细胞凋亡中内质网应激途径和线粒体途径的交叉应答机制

Aseptic loosening is a major cause of the failure of artificial joint replacement. Previous studies have confirmed that the apoptosis of macrophage is induced by wear particles within the interface membrane, and is associated with periprosthetic osteolysis and aseptic loosening. The inhibition of macrophage apoptosis can reduce osteolysis and prevent prosthesis loosening. However, the apoptotic mechanism of macrophage is still unclear, particularly there is a little study on the way of choosing a key target protein regulating apoptosis to treat osteolysis and prosthetic loosening . In this study, it is proposed that macrophage apoptosis is induced by wear debris through the ER stress pathway and mitochondrial pathway, in which GADD153/TRB3/AKT/Bad signaling is involved in the cross-talk. The inhibitation of GADD153/TRB3/AKT/Bad signaling could effetively inhibit macrophage apoptosis and prevent osteolysis. To verify this hypothesis, we investigate the clinical cases to find typical phenomenon, make cell experiments in vitro to prove its mechanism and identify target proteins, and make further animal experiments in vivo to confirm the treatment effect.The significance of this study is to provide a new idea and method for the prevention and treatment of periprosthetic osteolysis and aseptic loosening, thus extending the longevity of artificial joints.

无菌性松动是人工关节置换术后远期失败的主要原因。既往研究证实人工关节周围界膜组织中的磨损颗粒诱导巨噬细胞凋亡，并与骨溶解及无菌性松动密切相关，抑制巨噬细胞凋亡，可以减轻骨溶解及预防假体松动。但目前研究的不足之处是巨噬细胞中凋亡信号的传导调控途径并未明确，特别是如何选择调控凋亡的关键靶点蛋白来治疗骨溶解和假体松动缺乏深入研究。本课题提出以下设想：磨损颗粒通过内质网应激途径和线粒体途径诱导巨噬细胞凋亡，其中GADD153/TRB3/AKT/Bad通路参与调控这两条途径之间的交叉应答，选择抑制GADD153/TRB3/AKT/Bad通路可以有效抑制巨噬细胞凋亡，预防骨溶解。课题通过临床病例发现现象，体外细胞实验证明机制及筛选靶点蛋白，体内动物实验证实治疗效果四部分内容验证以上设想。本课题的研究意义在于为预防治疗假体周围骨溶解及无菌性松动提供一种新的思路和方法，从而延长人工关节的使用寿命。

项目组按照实验计划完成了原定的实验目标，我们发现无菌性假体松动的临床病例中，存在界膜组织巨噬细胞的凋亡、内质网应激途径和线粒体途径标志蛋白的表达，以及信号通路中TRB3以及AKT的表达。这些实验结果在现象层面上提示了界膜组织巨噬细胞发生凋亡过程中可能存在的分子机制。但是免疫组化技术无法揭示这些信号蛋白是如何依次被激活的，也无法解释其各自的因果关系。在体外细胞学试验中，我们使用磨损颗粒Ti-6AL-4V对巨噬细胞进行诱导，进一步揭示出了cytochrome c、Bad、caspase 9、GRP78、GADD153、caspase 12等凋亡关键蛋白的作用，证实磨损颗粒Ti-6AL-4V诱导巨噬细胞凋亡的过程中,存在内质网应激途径和线粒体途径中如cytochrome c、Bad、caspase 9、GRP78、GADD153、caspase 12等凋亡关键蛋白的激活。实验同时也发现，GADD153的下游作用机制可能较为复杂，其对TRB3以及AKT的调控可能存在其他机制，导致对Bad的调控未得到预期的结果。这些实验结果加深了我们对磨损颗粒Ti-6AL-4V诱导巨噬细胞凋亡机制的理解。在以上结果的基础上，我们通过RNA干扰技术证实抑制GADD153的表达尽管可以抑制部分巨噬细胞凋亡，但是不能调控Bad的转位，这提示GADD153可能对对线粒体途径的调控作用有限。进一步使用TRB3 siRNA抑制TRB3的表达，也未发现cytochrome c的释放及Bad的转位有明显变化，我们分析以上现象，认为TRB3 和AKT作为重要靶点蛋白，受到多种调控机制如PPAR-α、Smad以及PI3K等的作用，这些信号网络可能并不产生单向效果。我们的研究证实了磨损颗粒Ti-6AL-4V诱导巨噬细胞过程中信号转导机制，并发现了抑制GADD153可以对磨损颗粒Ti-6AL-4V诱导的巨噬细胞凋亡进行部分调控，该研究对于治疗无菌性假体松动中的骨溶解提出了新的思路和药物靶点，有助于提高关节置换术后假体的长期稳定性。