应用斑马鱼前向遗传学策略筛选和识别正常和白血病肿瘤干细胞自我更新的信号转导路径

正常造血干细胞发育和自我更新信号转导路径的识别，是理解人类白血病肿瘤干细胞恶性转化机制和开发针对肿瘤干细胞靶向治疗策略的关键。正常和恶性造血干细胞因其与微环境相互作用的复杂性，使我们需要在四维时-空框架内，即在一个活的动物体内筛选和识别调控造血干细胞自我更新的关键分子。基于斑马鱼造血系统遗传学调控网络与人类高度保守性，我们设计应用ENU化学诱变技术，获得1000个斑马鱼隐性遗传突变家系；采用全胚胎原位杂交技术，通过在第三代进行遗传学筛选，确定影响定向造血干细胞发育，迁移和自我更新的突变家系4-6个，并定位克隆这些关键"节点"基因。以此基因作为"抓手"，研究造血干细胞发育和自我更新的信号转导路径，并评估它们在白血病干细胞恶性转化中的地位和作用，为后期白血病干细胞靶向治疗和新药开发奠定理论和物质基础。该项目是国际上第一例针对定向造血干细胞进行的大规模三代活体遗传学筛选。

以斑马鱼为模式生物，应用ENU化学随机诱变技术“制造” 斑马鱼突变家系，采用全胚胎原位杂交技术在全基因组规模筛选出影响定向造血干细胞发育的隐性遗传突变家系，定位克隆相关基因，期望能识别1-3个参与造血干细胞发育的重要基因及分子信号路径。同时，利用实验室已有的工作基础、斑马鱼品系资源和技术平台，探索一些重要编码基因、微小RNA和组蛋白甲基化修饰在斑马鱼造血发育中的作用，并利用已建立的转基因模型进行小分子化合物筛选和相关机制研究。通过课题组全体成员的齐心努力，取得以下的进展：1.采用全胚胎原位杂交技术，通过大规模的筛选和验证，获得造血干细胞突变家系106家。现已成功定位克隆出了9个突变基因，并开始深入研究这些基因的生物学功能和分子调控机制。发现其中一个突变基因是位于斑马鱼23号染色体上的plcg1基因，可通过影响粒细胞中颗粒生成来调控粒细胞的成熟过程。2.阐明人类5号染色体长臂上白血病关键缺失区内一个潜在的肿瘤抑制基因即CTNNA1基因失活的的表观遗传调控机制及一个与白血病发生相关的分子调控路径：PTEN-C/EBPalpha- CTNNA1轴。3. 通过建立显性负C/ebpα转基因斑马鱼模型，发现显性负的C/ebpα蛋白通过上调重要的表观遗传学调控因子Bmi1，可调控早期造血干细胞的生存和自我更新能力。4.发含有SET结构域、具有潜在组蛋白甲基转移酶活性的Setdb2蛋白，通过对下游Fgf8信号通路的负性调控，在斑马鱼胚胎背侧组织者和左右不对称轴的建立中发挥重要作用。5. 发现miR-34b在斑马鱼发育过程中特异的表达在肾管多纤毛细胞中，通过miR-34b-cmyb信号路径可调控肾管多纤毛细胞的多纤毛发生过程，并进而影响肾管内液流动的速度，从而调控斑马鱼成体造血器官——肾脏的形态发生。6. 利用可示踪的、特异性标记巨噬细胞lyz-GFP转基因斑马鱼模型，筛选获得2种能有效抑制巨噬细胞炎性迁移的小分子化合物，一种是大麻碱受体CB2的激动剂，另一种是5-LO(脂氧化酶)的抑制剂，二者可通过JNK-c-Jun信号通路发生相关性，合用后对抑制炎性迁移具有显著协同效果。相关工作已分别在国际核心学术期刊《Blood》、《PNAS》上发表标注课题资助号的论文3篇，另有1篇论文已在线发表，2篇论文正在投稿中。本项目实施期内培养1名硕士研究生、4名博士生毕业。