基于患者特异的非基因整合iPSC和基因编辑技术进行肌萎缩侧索硬化发病机制的研究

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease that primarily affects motor neurons (MNs) and has no effective treatment. However, the mechanisms underlying motor neuron loss in ALS are poorly understood. Clinical drug trails have failed partly due to a lack of appropriate disease models, including a lack of access to MNs from ALS patients. Induced pluripotent stem (iPS) cells derived from patients with ALS provide an indispensable resource for in vitro mechanistic studies and for future patient-specific cell-based therapies. . Therefore, to establish a model for use in clinical applications, we generate integration-free iPS cell lines by episomal vectors from ALS patients with different mutations. The ALS-iPS disease model established represents a multifaceted practical platform for studying ALS pathogenesis, for discovering novel therapeutic drugs and for the development of ALS cell replacement therapies.. Using CRISPR/Cas9 genome editing tool to edit the mutation in the patient-derived iPSC. Differentiate ALS patient-specific iPS cells with mutation and corrected mutation into MNs. And further explore the roles of mutation gene on cell survival, apoptosis and necrosis in iPSC-derived motor nuerons from ALS patient. This study will provide a better understanding on the pathogenesis of ALS in Chinese population, and bring new insights on the treatment of ALS.

肌萎缩侧索硬化(ALS)是一类上、下运动神经元损害并存的致死性神经系统变性病。其确切的发病机制不清，尚无临床有效治疗的原因与目前缺少有效的疾病模型有关。来源于病人特异的诱导性多能干细胞因携带有病人全部的疾病遗传信息，是体外研究ALS发病机制的良好的人源性疾病模型，且可以用于将来的细胞替代治疗。因此，本课题结合前期工作基础，利用非基因整合技术建立不同基因突变的ALS患者特异的ALS-iPS疾病模型并加以验证。在此基础上，运用CRISPR/Cas9介导的定点编辑技术，在iPSC中将突变基因修正成野生型。将基因修正和未修正的iPSC均诱导分化成运动神经元，对照研究突变的基因通过哪些信号通路，引起神经细胞的凋亡与坏死，导致神经退行的病理效应。本研究建立的疾病模型及研究结果，将为研究中国人群ALS发病机制、药物筛选及将来的替代治疗提供良好的平台和实验依据。

肌萎缩侧索硬化(ALS)是一类上、下运动神经元损害并存的致死性神经系统变性病，确切的病因及机制不清，无有效治疗，其根本原因与缺少有效的疾病模型有关。本项目在原有研究的基础上,完成了以下内容:.1.建立已知基因突变ALS患者皮肤成纤维细胞库:目前采集了50多例ALS患者成纤维细胞系。.2.应用逆转录病毒导入外源性的Yamanaka转录因子(Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc)皮肤成纤维细胞方法建立ALS患者iPS系:并采用核型分析、免疫荧光染色、定量反转录PCR、甲基化分析以及畸胎瘤形成实验对 iPS 细胞进行全能性鉴定，通过抑制SMAD信号通路诱导iPS 细胞为运动神经元。由ALS-iPS细胞定向分化的运动神经元，能够模拟疾病特征性的病理变化，为中国人群家族性ALS疾病的研究及药物筛选提供了不可替代的资源。.3.应用非基因整合的方法建立外周血FALS患者iPS.使用Amaxa Nucleofe, ctor® I电转仪及相关电转试剂将非整合型epsisomal质粒导入FALS患者外周血单个核细胞中，建立了非基因整合的FALS特异性的 iPS 细胞系。采用E8培养基,并能在Xeno-free培养体系中长期稳定培养，这种iPS细胞避免外源基因整合到基因组中，且去除了动物源性饲养细胞及动物血清成分对人iPS细胞的影响，操作简单快速，更适合于将来的临床应用。.4.携带三种不同突变位点的运动神经元诱导过程中细胞活力变化：ALS患者和正常人的iPS细胞在培养中细胞形态、分化中细胞数目、生长速度明显不同,Western blot检测，不同突变类型病人的iPSCs和MNs相比正常组SOD1水平均升高; 不同突变类型病人MNs 和正常组MNs，线粒体膜电位ΔΨm明显降低;突变组细胞内Ca2+显著增高。 .5.ALS-iPS来源神经前体细胞能够改善ALS模型鼠的运动功能：神经前体细胞移植组小鼠的运动功能相对其他三组有明显改善，提示ALS-iPS来源神经前体细胞可能是ALS患者细胞治疗的另一种合适细胞来源,它们能够存活于植入脊髓且迁移到前角，它们能够延缓运动神经元的减少，因而延缓病情恶化并延长生存期。