"双酶一体"连续催化体系的建立及其研究

Two enzymes work together for the catalysis in two-step reactions. In these bioreactions, the product of one enzyme is the substrate of the other. This project will establish and study the two-enzyme systems. The model two-enzyme systems include D-Amino acid oxidase/catalase,glucose oxidase/catalase, and alpha-amylase/glucoamylase. Enzyme splicing will be carried out though the self catalysis of intein, which is carried out outside the cells. This is the novelty of the project. The methodology of establishing two-enzyme systems is different from that by gene fusion for the expression of hybrid proteins. This project will study the enzyme splicing efficiency, the interaction of the enzymes of the two-enzyme with the substrates. It is expected that the developed methodology of establishing two-enzyme systems can be extended to the establishment of multi-enzyme systems.

两种酶共同作用以催化两步反应过程。双酶催化的优点是第一个酶催化后的产物可被第二个酶作为底物催化，这样可更高效率地催化反应物。本项目拟建立并研究"双酶一体"催化体系。拟研究的模式双酶体系为D-氨基酸氧化酶/过氧化氢酶，过氧化氢酶/葡萄糖氧化酶，淀粉酶/糖化酶。在细胞外通过内含子自我催化，以短链肽把两种酶紧密连接为一体，这是本项目的创新之处。拟研究的酶连接过程不需要其它酶和化学催化剂催化。由于是在细胞外通过自我剪接的方法把两种酶连接起来，因而本项目有别于通过基因融合在细胞内表达融合蛋白的方法。本项目将比较研究"双酶一体"体系与两个酶混合使用的催化效率。研究酶连接效率及其影响因素、"双酶一体"与底物的作用机理。期望本项目研究的酶连接方法能够应用于"多酶一体"体系的构建。

酶作为生物催化剂在医药、食品和化学品制备等方面有着广泛的应用。一些酶催化过程是由两种或两种以上的酶共同催化完成两种。双酶催化的优点是第一个酶催化后的产物可被第二个酶作为底物催化，这样可更高效率地催化底物以及提高对底物的选择性。在双酶体系中，酶与酶之间的空间位置与距离对双酶催化有着重要影响。本项目研究建立 "双酶一体"催化体系。通过蛋白质剪接技术，D-氨基酸氧化酶亚基的N端通过肽键与过氧化氢酶亚基的C端相连接。这样特异性地连接D-氨基酸氧化酶和过氧化氢酶，使得酶与酶之间活性中心的距离为分子间距离，十分有利于中间产物过氧化氢在两种酶活性中心之间的传递。双酶经过特异性连接后，原酶仍然保持了原有的二级结构。所构建"双酶一体"结构提高了酶的稳定性。酶活研究结果表明，"双酶一体"的催化效率是D-氨基酸氧化酶的效率22.4倍。另外，本项目还研究了把双酶（淀粉酶和糖化酶）共固定在碳纳米管/二氧化硅载体以及把超氧化物歧化酶和过氧化氢酶共固定在聚天冬氨酸微球上。共固定提高了双酶的酶催化效率和稳定性。在细胞外通过内含子自我催化，以短链肽把两种酶紧密连接为一体，这是本项目的创新之处。本项目在Green Chemistry和Bioconjugate Chemistry等期刊发表多篇文章。.本项目通过酶亚基特异性剪接把两种酶连接在一起构建双酶体系，是一全新的构建双酶体系方法。该方法可用于构建其它双酶体系，具有广泛应用意义。本项目所构建的D-氨基酸氧化酶/过氧化氢酶双酶体系，具有催化效率高和稳定性性强的特点，有希望在制备药物中间体领域得到应用。