D-氨基酸氧化酶特异性固定及其催化研究

D-Amino acid oxidases are extensively applied to separate racemic mixtures of amino acids and to manufacture the important intermediate compounds. Enzyme immobilization is a method for improvement of enzymatic efficiency and stability. This project is to specifically immobilize D-amino acid oxidase. Spherical silicon will be functionalized with hematin, and D-amino acid oxidase will be immobilized on the spherical silicon by coupling to the hematin. The specific enzyme immobilization enables the DAAO in proximity to the hematin at a molecular distance. The molecular-distance proximity facilitates the immediate decomposition of H2O2 catalyzed by the hematin. The evolved oxygen can be efficiently utilized to oxidize the reduced cofactor FDA of DAAO and H2O2 is produced. The forming of H2O2-O2-H2O2 circle between the DAAO and hematin is a driving force to accelerate the deamination reaction. This project will demonstrate an approach for highly specific enzyme immobilization onto spherical silicon. The approach can be extended to other nanomaterials, possessing potential applications in oxidase-based cascade catalysis processes.

D-氨基酸氧化酶（DAAO）在手性氨基酸拆分和药物中间体制备等方面具有广泛应用。酶固定化是提高DAAO催化效率和催化稳定性的一个有效方法。本申请拟研究DAAO定向固定及其催化应用。所提出的酶固定方法分为两个步骤。（1）卟啉铁功能化硅胶球：在硅胶球外包覆巯基硅氧烷；通过卟啉铁的乙烯基与巯基反应，把卟啉铁接枝到硅胶球表面。（2）DAAO的定向固定：通过DAAO表面的氨基与卟啉铁的羧基反应，把D-氨基酸氧化酶固定在功能化硅胶球上。所提出的DAAO固定方法具有如下特点：DAAO与卟啉铁以分子的距离紧邻；DAAO催化后产生的副产物双氧水能够被卟啉铁快速催化而分解为水和氧气；所产生的氧气富集在DAAO周围，可被DAAO的辅因子FAD有效利用；这样的连续循环催化加速了DAAO催化底物的速率。本项目申请将把固定化DAAO应用于手性氨基酸拆分和药物中间体催化合成。

D-氨基酸氧化酶在制备L-氨基酸、中间体手性胺和生物检测等方面有广泛应用。ɷ-转氨酶被用于催化制备手性胺以合成药物。本项目研究了对D-氨基酸氧化酶的特异性固定以及对D-氨基酸氧化酶和ɷ-转氨酶的共固定。无论是对单酶还是对双酶的固定，用于固定酶的载体都具有模拟酶的功能。这样固定酶具有多酶催化功能。. 在血红素功能化的碳纳米管上特异性固定D-氨基酸氧化酶。血红素具有过氧化氢酶功能。以血红素为连接点固定D-氨基酸氧化酶，使得D-氨基酸氧化酶与血红素以分子距离紧邻。这样固定酶具有双酶功能。D-氨基酸氧化酶产生的过氧化氢被血红素分解产生氧气和水。生成的氧气被循环利用氧化还原态的D-氨基酸氧化酶辅酶FAD。反应中形成了从H2O2 → O2 → H2O2 的循环，该循环是加速D-氨基酸氧化酶催化反应的主要推动力。催化结果表明，固定D-氨基酸氧化酶的催化效率是游离酶的3倍多。.制备了锆/二氧化锰中空微球共固定D-氨基酸氧化酶和ω-转氨酶。由于中空微球表面包覆锆配位聚合物，空心微球可以选择性地吸附酶。空心微球具有很高的酶吸附率。所吸附的酶与空心微球具有很强的相互作用。空心微球具有氧化酶和过氧化氢酶性能。在共固定D-氨基酸氧化酶和ω-转氨酶后，固定酶具有三酶性能。固定酶用于转化胺类化合物。在催化过程中形成pyruvate→D→alanine-pyruvate循环和H2O2→O2→H2O2循环。催化结果表明，双酶固定在空心微球上后，酶催化效率得到极大提高。