脂肪酶CAL-B催化金属氧化还原反应建立酶/金属杂化催化剂体系的机制研究

Abstract:.Enzyme/metal biohybrids, which have combined selectivity of enzymatic catalysis and catalytic diversity of transition metals, are becoming a new growing point in biochemical field. In our previous works, we have found that lipase CAL-B possesses the unnatural catalytic potential to reduce metallic ions and oxidize metals, which is a particular performance of enzymatic catalytic promiscuity. The mechanism of the particular performance should be highlighted in order to expand biohybrids’ system which used to be constructed by incorporation of metallic ion or complex within a biomolecular scaffold, and provide an efficient method to prepare Enzyme/metal biohybrid catalysts. In this project, two kinds of biohybrids CAL-B/MNPs and CAL-B/M_2+ have been studied. The experimental methods include QM/MM computation, redox capability study, examining the effects of neighboring amino acids in a peptide sequence, and applying site-directed mutation technique. As a result, we confirm the critical amino acids and sequences, understand the influence of enzymatic active site and stereo structure, then establish the mechanism of metallic ion reduction and metal oxidation catalyzed by lipase CAL-B. On the basis of the defined mechanism, pointed screening of biomolecules has been set up by employing bioinformatics technology, which will furnish a methodological support for regulating the combination of biomolecules and metallic patterns to catalyze specific biochemical reactions.

酶/金属杂化催化剂融合了酶催化的选择性及过渡金属催化的多样性，已成为生物化学领域备受关注的新生长点。课题组前期研究发现脂肪酶CAL-B具有原位还原金属离子及催化金属元素氧化的非天然反应能力，是酶催化多功能性的一种特殊体现。阐明其对金属氧化还原反应的作用机制，可以拓展现有的通过金属离子或复合物与蛋白质骨架相结合建立的酶/金属杂化催化剂体系，提供一种高效易行的酶/金属杂化催化剂制备方法。本项目以CAL-B/MNPs和CAL-B/M2+两类杂化催化剂为研究对象，通过量子力学/分子力学模拟计算、氨基酸氧化还原能力筛选、设计合成多肽研究氨基酸序列的影响、结合酶定点突变技术，确定关键氨基酸及序列，掌握酶催化活性位点和空间立体结构的影响，确立酶CAL-B催化金属氧化还原反应的作用机制；基于生物信息学技术，建立生物大分子的针对性筛选方法，为调控生物大分子和金属的组合方式以催化特定生物化学反应提供方法支撑。

酶/金属杂化催化剂结合了酶和金属各自的催化特异性，赋予了其更佳的立体选择性和区域选择性等催化性能，实现了人工金属酶的催化多功能性。本项目通过酶CAL-B对金属的氧化还原作用，制备了CAL-B/M2+和CAL-B/MNPs两类酶/金属杂化催化剂。然而，通过紫外-可见光光谱和傅立叶变换红外光谱对铜离子产物和醋酸铜进行了比较，发现得到的产物仅仅是金属离子的醋酸盐，所以金属氧化反应实际上只是酶催化的串联反应。通过一系列表征图谱（EDX、HRTEM、XPS）证明了杂化催化剂CAL-B/MNPs中含有相对应的金属元素，并以单质的形式存在，以及纳米颗粒分布比较均匀，大小不超过5 nm，且清晰显示了不同金属元素的晶格条纹；通过MALDI-TOF-MS表征数据以及金纳米颗粒标记酶CAL-B，证实了杂化催化剂CAL-B/MNPs中酶的存在。设计了多肽AGLFFSSKDL，还原Na2PdCl4得到的钯纳米颗粒分布较均匀，颗粒尺寸较小，约为3~5 nm。通过对酶CALB空间结构的分析，发现脂肪酶CAL-B 111位至128位的氨基酸序列中AGLFFSSKDL通过氢键作用形成稳定空间结构。对其中的氨基酸FF进行定点突变（F117A，F118A），发现CAL-B突变株仍然能原位还原Na2PdCl4，得到的钯纳米颗粒尺寸小于10nm，但大小不均一，且分布不是很均匀。稳定空间结构AGLFFSSKDL中的其它氨基酸可能是决定颗粒大小的关键性因素，进一步设计了多肽AGLFFAAAAL和AQGLFFARAAVARL，还原Na2PdCl4生成的钯纳米颗粒分布非常不均匀，且大小不均一，尺寸均大于10nm，部分颗粒尺寸接近20nm。对酶CAL-B的关键位点进行突变（S120A，S123A，K124A，D126A），得到的CAL-B突变株纯化后还原Na2PdCl4，发现生成的钯颗粒分布不均匀，大小不均一，尺寸大于10nm。所以，证实了稳定空间结构AGLFFSSKDL是酶CAL-B中起决定性作用的氨基酸序列，决定了酶还原金属离子成为纳米颗粒的形态、大小及分布情况。通过数据库BLAST检索比对，发现蛋白protein CcmG和DsbE具有CAL-B类似的稳定空间结构AGLFFSSKDL，推测应该也能原位还原金属离子，生成均一的纳米颗粒。该项目促进了化学和生物学的交叉融合，为研究成果的普适性和推广奠定坚实的基础。