基于超分子自组装和级联反应动力学计算的双酶复合催化体系构建及其催化特性研究

This project focus on a typical two-enzyme cascade system (glucose oxidase /catalase) in biocatalytic processes, studying on self-assembly of supramolecular double enzyme complex by cyclodextrin host-guest recognition mechanism on the basis of a single molecule nano enzyme preparation. The research methods include Using kinetic model calculations, molecular modeling tools to guide supramolecular enzyme construct, combined with a variety of experimental analysis (multidimensional NMR and confocal microscopy, etc.) .The molecular recognition and interaction mechanism of the enzymes will be investigated, especially the typical biocatalyst enzyme catalytic efficiency, stability and dynamic behavior after enzymes self-assembled.On the meanwhile, the impact of the distance of two enzymes on synergies and catalytic efficiency of the supramolecular enzyme complex will also be investigated.The project will clarify the relationship between the design and supramolecular structures and the catalytic efficiency of enzyme complex, providing the foundation for the construction of novel supramolecular multi-enzyme system.

多酶催化耦合多步生化反应，中间产物不经分离直接被下一步酶催化转化，提高了时空转换效率。中间产物在酶分子之间的传质过程是多酶催化的主要限制因素。通过合理构建超分子复合体，约束中间产物扩散，将有利于多酶反应过程。本项目以生化过程中典型的双酶级联反应体系（葡萄糖氧化酶与过氧化氢酶）为研究对象，在制备单分子纳米酶基础上，研究基于环糊精主客体识别机制的特定结构的双酶超分子自组装，构建高效的葡萄糖氧化酶/过氧化氢酶超分子双酶复合体。采用反应动力学模型计算、分子模拟手段指导超分子酶构建，结合多种实验分析方法（多维核磁和激光共聚焦显微技术等）进行表征，研究纳米超分子双酶体系中酶的比例、距离对双酶的协同效应和催化效率的影响，对比两种酶简单混合使用的催化效率和动力学行为，阐明超分子双酶复合体中的底物传递规律以及超分子结构设计与催化效率之间的关系，为新型超分子多酶体系的构建和机理研究建立实验和方法基础。

本项目以生化过程中典型的多酶级联反应体系为研究对象，围绕多酶反应中底物抑制，中间产物高效传递，辅因子能量供给关键科学问题展开了研究。首先，通过超分子识别β-环糊精（接枝到GOX）和金刚烷（接枝到CAT）证明了构建葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶基质的有效方法。这在简单混合后自发地形成自组装多酶系统（SAME）。在SAME，GOX活动和k cat / K m比GOX / CAT混合物高3.7和7倍。对比两种酶简单混合使用的催化效率和动力学行为，阐明超分子双酶复合体中的底物传递规律以及超分子结构设计与催化效率之间的关系，为新型超分子多酶体系的构建和机理研究建立实验和方法基础。其次，采用一种生物交联剂谷氨酰胺转氨酶（TGase），利用其特异性识别位点的性质，实现多酶有序组装的过程。实现了甲酸脱氢酶（FateDH）和碳酸酐酶（CA）两种酶利用TGase交联，形成“CA—FDH”的双酶超分子，缩短了底物传递距离，提高蛋白质结构的稳定性。另外采用京尼平交联的葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶超分子复合体，其中葡萄糖氧化酶最高活力为1100U/mg，过氧化氢酶最高活力为4000U/mg,催化效率比游离酶混合提高了6倍。另外，构建了辅因子再生的复合多酶超分子系统，研究了限制域双酶固定ppk激酶和谷胱甘肽合成酶，构建了有机-无机复合超分子，实现谷胱甘肽合成中，利用多聚磷酸实现了持续供给辅因子问题，该复合超分子中谷胱甘肽合成酶的储藏稳定性提高70倍，ppk激酶的储藏稳定性提高20倍，该限域仿生固定化酶可以连续使用7批。此外，采用层层自组装技术，构建双酶固定ppk激酶和谷胱甘肽合成酶超分子体系，稳定性进一步增强，可连续使用10批。探索了基于类石墨烯和MOFs材料的光催化还原NADH的超分子酶还原co2系统，辅因子再生效率可达60%。在国内外刊物和重要会议上发表SCI 收录论文10篇；申请国家发明专利5项；培养研究生10名；入选北京市科技新星（A类）1人次；组织国际相关的学术会议2次并在国际性会议上介绍有关成果，与国际同行交流3次。