纳米生物反应器内固定双酶及催化制备2,5-呋喃二甲酸的研究

2,5-Furandicarboxylic acid (FDCA) is an important platform chemical. It is determined by the Department of Energy of USA as a green chemical. Efficient preparation of 2,5-Furandicarboxylic acid has been continuously perused. This project intends to synthesize 2,5-Furandicarboxylic acid form 5-hydroxymethylfurfural (HMF) under the catalysis of a two-enzyme system in nano-bioreactors. Recombinant 5-hydroxymethylfurfural oxidase (HMFO-ELP) and heme-thiolate peroxidase (HTP) are sequentially immobilized in nanoporous supports. HMFO-ELP catalyzes the oxidation of HMF to produce FDCA via following route, HMF→2,5-diformylfuran(DFF)→2,5-formylfurancarboxylic acid (FFCA)→FDCA, in the meantime H2O2 is generated. HTP catalyzes the oxidation of FFCA producing FDCA and H2O2 is used as co-substrate. This project will investigate the mechanism of coordinated catalysis by the two enzymes, the mass transfer of substrate and product within the nano-bioreactors, and the interactions between the substrate and the enzyme. It is intended to improve the efficiency of HMF conversion and the yield of FDCA under the coordinated catalysis by the two enzymes.

2,5-呋喃二甲酸(FDCA)被美国能源部确认为未来“绿色”化学工业的一种重要平台化合物。高效制备2,5-呋喃二甲酸是研究者们的追求目标。本项目拟以5-羟甲基糠醛(HMF)为底物在纳米生物反应器内通过双酶催化氧化HMF制备FDCA。首先制备多纳米孔硅胶球载体。把重组5-羟甲基糠醛氧化酶(HMFO-ELP)和血红素硫醇过氧化物酶（HTP）次序地固定在载体的纳米孔内，形成纳米生物反应器。HMFO-ELP催化氧化HMF生成FDCA的路径为HMF→2,5-二甲酰基呋喃(DFF)→5-甲酰基-2-呋喃甲酸(FFCA)→FDCA，同时产生副产物H2O2；HTP催化氧化中间产物FFCA→FDCA，同时利用H2O2作为共底物。本项目拟研究双酶协同控制催化机制以及纳米生物反应器限定空间内底物和产物扩散传递规律及底物与酶作用机理。通过双酶协同催化，提高底物和中间产物转化率、副产物利用以及产物FDCA收率。

2,5-呋喃二甲酸可取代对苯二甲酸合成各种聚酯，也可用于合成聚酰胺。氧化5-羟甲基糠醛是生产2,5-呋喃二甲酸的一种途径。氧化5-羟甲基糠醛可以从生物质原料制备。本项目研究了5-羟甲基糠醛氧化酶催化氧化5-羟甲基糠醛制备2,5-呋喃二甲酸。5-羟甲基糠醛氧化酶的应用遇到了两个问题：一个是5-羟甲基糠醛氧化酶在大肠杆菌中表达后，主要以包涵体形式存在。另一个问题是，副产物过氧化氢对5-羟甲基糠醛氧化酶(HMFO)的二级结构和稳定性有破坏作用。为了解决这些问题，通过将5-羟甲基糠醛氧化酶的C-末端与弹性蛋白样多肽（ELP）融合来产生重组5-羟甲基糠醛氧化酶。重组酶ELP-HMFO在表达时可显著地减少包涵体。而且重组酶ELP-HMFO具有更好的稳定性和对过氧化氢的耐受性。通过将5-羟甲基糠醛氧化酶的N-末端与富含谷氨酸的多肽（ZE）融合而进一步重组该酶。为了消除过氧化氢的副产物抑制作用和对酶结构影响，把过氧化氢酶（CAT）与重组5-羟甲基糠醛氧化酶联用。把过氧化氢酶N-末端与ELP融合并将C-末端与富含精氨酸的多肽（ZR）融合，获得重组过氧化氢酶ZR-CAT-ELP。ELP-HMFO-ZE可与ZR-CAT-ELP特异性相互作用。ELP-HMFO-ZE#ZR-CAT-ELP具有两种酶的催化活性。ELP-HMFO-ZE催化氧化5-羟甲基糠醛，生成的过氧化氢被ZR-CAT-ELP分解为水和氧气。在催化氧化5-羟甲基糠醛过程中，5-羟甲基糠醛氧化酶的辅因子FAD被还原FADH，需要氧气对FADH进行再氧化。过氧化氢分解释放的氧气正好满足这一要求。由于两种酶之间的距离较短，过氧化氢和氧气可以有效地在ZR-CAT-ELP和ELP-HMFO-ZE之间扩散和传递。双酶体系极大地提高了催化氧化 5-羟甲基糠醛制备2,5-呋喃二甲酸的效率。同时，该双酶体系具有高稳定性，为工业应用奠定了基础。