端粒再生与卵巢功能重建

Telomeres are composed of repeated DNA sequences (TTAGGG)n and associated proteins located at the chromosome ends, and maintain chromosomal stability. Telomeres shorten with age, in general, and particularly dysfunction of ovaries including their germ cells, follicular granulosa cells and niches occurs with age and these compartments also show telomere shortening and dysfunction. We previously showed that telomere shortening causes infertility and premature ovarian aging using telomerase knockout mouse model. In this proposal, we intend to test the hypothesis that telomeres can be rejuvenated in germ cells and granulosa cells （pre-granulosa cells）by pluripotent stem cell technology and that telomere-rejuvenated germ cells and granulosa cells （pre-granulosa cells）can be used for reconstruction of functional ovaries. We also will investigate the mechanisms underlying the negative impacts of short telomeres on differentiation of germ cells and granulosa cells (pre-granulosa cells), causing infertility and premature ovarian aging. To achieve these goals, we propose three main research areas of studies: 1) Telomere rejuvenation by creating pluripotent stem cells from oocytes for differentiation to germ cells and granulosa cells (pre-granulosa cells) to reconstruct ovarian function; 2) Telomere rejuvenation by creating pluripotent stem cells from granulosa cells (pre-granulosa cells) for differentiation to germ cells and granulosa cells（pre-granulosa cells）to reconstruct ovarian function; 3) Telomere rejuvenation and reconstruction of ovarian function in ovarian premature aging mouse model using telomerase knockout mice. Eventually, we aim at reconstituting artificial ovaries for recover of ovarian functions using different mouse models including natural ovarian aging mice, chemo-treated mice, and telomerace knockout mice with premature ovarian aging. If proven to be successful in mouse models, this will be significant for combating natural ovarian aging in women, and for improving reproductive life span of chemo-therapy and premature ovarian aging patients.

端粒由DNA重复序列（TTAGGG)n及相关蛋白组成,位于染色体末端维持染色体稳定性。端粒随着细胞增殖、分化或年龄增长而缩短。端粒缩短及其功能紊乱会影响生殖细胞、颗粒细胞及微环境，可导致卵巢衰老及不孕不育。在本项目申请中，我们期望验证这样一个假设：通过多能干细胞技术可以使卵子及颗粒细胞的端粒得到再生，从而有效用于卵巢功能重建。并进一步探究端粒变短影响生殖细胞及前体颗粒细胞分化、引起卵巢早衰及不育的分子机制。我们以小鼠作为实验模型，提出了三个主要研究内容：1）卵子端粒再生用于卵巢功能重建；2）颗粒细胞端粒再生用于卵巢功能重建；3）通过修复端粒酶基因使端粒和卵巢功能恢复。最终，我们期望通过重建卵巢功能，恢复自然衰老小鼠、化疗小鼠及端粒酶敲除小鼠的生殖和内分泌功能。本项目在小鼠模型研究中获得成果，期望会对人类卵巢功能重建及卵巢衰老机制提供新的认识和有重要意义的前期基础。

端粒缩短及其功能紊乱会影响生殖细胞、颗粒细胞及微环境，可导致卵巢衰老及不孕不育。本项目旨在研究通过多能干细胞技术是否可以使卵子及颗粒细胞的端粒得到再生，从而有效用于卵巢功能重建。并进一步探究端粒变短影响生殖细胞及前体颗粒细胞分化、引起卵巢早衰及不育的分子机制。围绕研究计划，我们主要得到以下结果:.（1）卵子端粒再生用于卵巢功能重建方面：通过孤雌激活，我们从卵子中成功获得pESCs，并进一步将pESCs分化形成PGCLCs和具有正常功能的卵子，在此过程中发现pESCs能够维持较完整的母源基因组印记和两条完全激活的X染色体。此外，我们确定了前体颗粒细胞发育过程中基因的表达模式，并确定了E12.5天性腺体细胞的构成和基因表达图谱。进一步，利用筛选的小分子可以将ESCs分化为pre-GCLCs，并证明其能支持PGCs进入减数分裂。.（2）颗粒细胞端粒再生用于卵巢功能重建方面：首先我们利用MEF探索了化学重编程的方法。进一步，通过优化的化学重编程方法，能够将成体颗粒细胞重编程为gPSCs，并证明gPSCs具有与ESCs相似的基因组稳定性并能够完成端粒再生。之后，我们可以将gPSCs分化形成PGCLCs和卵子，并证明gPSCs获得的卵子具有稳定的基因组和正常的功能。.（3）通过修复端粒酶基因或重聚卵巢的技术手段恢复卵巢功能恢复方面：阐明了端粒缩短影响PGCs特化和减数分裂起始受阻的机制，进一步，通过在Terc-/- ESCs中导入端粒酶基因Terc，能够恢复端粒长度和正常的基因表达模式，并能够恢复PGCs特化和减数分裂起始的能力。.（4）证明mTOR抑制剂能够成功维持重建卵巢中长时间的卵泡发育；并通过肾包囊移植技术重建卵巢，恢复自然衰老小鼠及端粒酶敲除小鼠中的卵泡发育和卵巢内分泌功能。此外，通过转录组和功能比较，确定卵巢生殖干细胞仅存在于胚胎期，而不存在于成体卵巢中。. 本项目通过多种手段成功完成小鼠卵巢功能重建，并在一定程度上恢复了小鼠的生殖能力，为人类卵巢功能重建及女性生殖健康提供新的理论依据及技术手段。