iPS细胞端粒重编程及其稳定性维持的分子机制

Embryonic stem cells show longer telomeres and higher telomerase activity than somatic cells. Rejuvenation of telomere lengths is criticl for long-term survival and self-renewal of induced pluripotent stem cells (iPS) for potential large scale clinical application. We and others recently demonstrated that lengths of telomeres are heterogenous and unstable in pluripotent stem cells, some with telomere lengths similar to those of ES cells, but others shorter or longer than ES cells. We also showed that telomere lengths affect genomic stability and developmental pluripotency of ES/iPS cells. However, molecular mechanisms underlying regulation and maintenance of telomere lengths, genomic stability and pluripotency of pluripotent stem cells remain to be determined. This proposal aims at understanding mechanisms of telomere length regulation and its role in the maintenance of genomic stablility of pluripotent stem cells. To achieve these goals, we have designed three main experiments: 1) Mechanism of telomere lengthening and stability during induction of iPS cells; 2) Roles and regulation of telomeres in iPS/ES cells during long-term proliferation in vitro; and 3) Relationship of telomere lengths with epigenetic reprogramming extent and pluripotency of iPS cells. Analysis of telomere regulatory mechanisms of iPS/ES cells may also help understanding of aging and cancer stem cells.

胚胎干(ES)细胞中端粒酶活性较高、端粒比成体细胞中长。端粒长度再生，对由成体细胞重编程而来的诱导多能干（iPS）细胞在长期培养、稳定扩增和大规模应用于临床非常重要。iPS细胞端粒长度存在不均一性和不稳定性，有的端粒长度与ES细胞相似，但也有些端粒较短。我们结果还表明，端粒长短明显影响小鼠多能干细胞（ES/iPS）基因组稳定性和发育多能性。但多能干细胞维持端粒长度和基因组稳定性、及发育多能性的分子调控机制仍不清楚。本课题试图详细阐明多能干细胞端粒长度调控的分子机制及其在维持基因组和表观遗传稳定性中的作用。设计了三个部分研究内容：1)iPS细胞诱导过程中端粒延长及稳定性维持机制；2)端粒在iPS/ES细胞体外长期传代增殖中的作用及调控机制；3)端粒长度与iPS细胞全基因组表观遗传重编程程度及多能性的关系。对ES/iPS细胞端粒调控机制的了解，也可能有助于认识衰老和肿瘤（干细胞）。

端粒长度及稳定性维持对多能干细胞长期培养和大规模扩增并应用于临床非常重要。本项目旨在研究诱导多能干细胞（iPS细胞）重编程过程和胚胎干细胞（ES细胞）多能性维持中，端粒调控的分子机制及其在维持基因组和表观遗传稳定性中的作用。围绕研究计划，得到以下主要结果：.1） 在iPS细胞诱导过程中端粒延长及稳定性维持机制研究方面，我们发现：iPS细胞诱导过程中端粒延长，端粒酶基因的激活要早于内源性多能性基因的激活，端粒酶机制和端粒酶非依赖机制都在其中发挥作用。探讨不同培养条件对iPS诱导效率的影响，发现KSR培养液可以提高iPS克隆形成的效率和质量。小鼠的卵巢颗粒细胞研究发现，其不表达LaminA，且仅用两个转录因子，Oct4与Sox2，能够将其诱导成为iPS细胞。.2）端粒在iPS/ES细胞体外长期培养中的作用及调控机制研究方面，我们发现：Tbx3 通过激活ES细胞中的Zscan4+/2细胞的状态，对ES细胞的端粒维持及自我更新起作用。亚端粒区组蛋白乙酰化修饰可以调控ES细胞端粒长度。对Tcstv1/3的功能研究发现，Tcstv1/3能够延长ES细胞的端粒长度。.3）端粒长度与iPS细胞全基因组表观遗传重编程及发育多能性的关系。通过全基因组基因表达谱分析，我们发现，Erk通路存在非Mek依赖性的作用途径； Erk通路对于小鼠ES细胞的端粒长度和基因组稳定性的维持是不可或缺的。Rif1在ES中高表达，但功能不清楚。我们通过RNAi 实验， 结合全基因组microarray和ChIP-seq分析，我们发现，Rif1通过维持亚端粒、端粒区H3K9me3的水平，防止Zscan4等2细胞胚胎基因异常激活，保持端粒长度的稳态。孤雌胚胎干细胞端粒长度比正常的胚胎干细胞长，通过全基因组microarray分析，我们发现，Zscan4等2细胞胚胎基因表达水平更高。通过基因组甲基化分析，我们发现，Tet酶通过调节DNA甲基化和羟甲基化水平维持端粒长度和基因组的稳定性。.本课题阐明了小鼠多能干细胞中端粒相关基因、表观遗传调控因子、信号转导，在端粒长度调控、多能干细胞自我更新及多能性调节中的作用机制，对于建立高效、安全的iPS/ES细胞并最终应用于临床治疗提供了科学依据。