猪瘟病毒NS5B作为RNA聚合酶的关键活性位点研究

Classical swine fever (CSF) is a highly contagious and often fatal disease in pigs, whose pathogen is Classical swine fever virus (CSFV). CSFV encodess 4 structural proteins and 8 nonstructural proteins. Nonstructural protein 5B (NS5B), is the most important protein for CSFV replication. Research on the catalytic position or the RNA binding domain is rare, especially on the 3-D structure of CSFV NS5B protein which still remains unknown. We previously expressed the CSFV NS5B protein in vitro and obtained the CSFV-NS5B crystal. Based on those results, this research proposal focuses on the RNA polymerase avtivity of CSFV NS5B. Through defining the co-crystal of CSFV NS5B and RNA template, the catalytic site of NS5B, shRNA interference as well as the CSFV proliferation assay, we hope to disclose the 3-D structure of CSFV NS5B and its active site as well as the dimensional conformation during the RNA replication. Thus, to contribute evidence to the novel drug design as well as the new target for vaccine development.

猪瘟是一种具有高度传染性和致死性的传染病，其病原体为猪瘟病毒（CSFV），基因组编码4个结构蛋白和8个非结构蛋白，非结构蛋白NS5B是猪瘟病毒复制增殖的关键蛋白。目前，针对CSFV NS5B的活性区域以及与RNA的结合位点研究还没有相关报道，尤其是NS5B蛋白的三级结构研究尚无报道。申请人前期工作已经成功表达了CSFV NS5B蛋白，并且得到了CSFV NS5B的蛋白结晶。在此基础上，本研究围绕CSFV NS5B的聚合酶活性，通过CSFV NS5B 蛋白与RNA 模板的底物共结晶、NS5B 关键活性位点实验、基于NS5B的shRNA干扰实验以及病毒增殖实验，最后解析CSFV NS5B蛋白的三级结构、关键活性位点以及在RNA复制过程中NS5B蛋白的构象变化，以期为新型药物和疫苗靶点的设计提供依据。

猪瘟病毒（Classical Swine Fever Virus, CSFV）是影响我国畜牧产业的重要病原体之一。CSFV基因组编码4个结构蛋白和8个非结构蛋白，非结构蛋白NS5B是猪瘟病毒复制增殖的关键蛋白。本研究针对CSFV-NS5B，从细胞水平、分子水平、蛋白质结构方面多角度阐释了CSFV-NS5B的功能及其结构域。首先，我们发现了CSFV-NS5B的新的活性位点，位于NS5B蛋白的282氨基酸位点处。其次，我们首次解析了CSFV-NS5B的蛋白结构，PDB文件号未5Y6R。第三，通过蛋白结构及体外的生化试验验证了，CSFV-NS5B在病毒复制增殖中的功能，及其关键的活性结构域，以及每一个结构域在病毒RNA复制中的具体功能。NS5B 不仅对猪瘟病毒的复制增殖起重要作用，同时，病毒 RNA 突变体的出现也是 NS5B 功能异常的直接原因。因此，探究 NS5B 的聚合酶功能及其 RNA复制机制，有助于我们防控猪瘟病毒突变及控制病毒毒力。我们的研究成果首次从蛋白结构层面揭示了猪瘟病毒非结构蛋白的三维精细结构，阐释了NS5B蛋白的功能域，为后续新型抗病毒疗法的挖掘提供了研究基础。