p27kip1的O-GlcNAc修饰促进细胞增殖在肝癌中的意义

The occurrence and development of tumor is often accompanied by abnormal energy metabolism. Multiple intracellular proteins are modified with O-GlcNAc through HBP (hexosamine biosynthesis pathway). p27kip1 plays an important regulatory role in cell proliferation, differentiation and malignant transformation in hepatocellular carcinoma. Our groups found that p27kip1 is O-GlcNAc modified, further research identified Ser2 as the glycosylation site of p27kip1. So we hypothesized p27kip1 O-GlcNAc modification affect HCC development via affecting p27kip1 gene expression. In this project, we intend to first prove that p27kip1 is O-GlcNAc modified. Secondly, we investigated the influence of O-GlcNAcylation on phosphorylation level. Thirdly, we analized the effects of O-GlcNAcylation on signal transduction pathway and investigated its effect on HCC proliferation. The project study provides experimental and theoretical basis for elucidation the pathogenesis of HCC, looking for its therapeutic targets.

肿瘤的发生发展常伴随能量代谢异常，其中氨基己糖生物合成途径能够使多种细胞内蛋白发生O-GlcNAc修饰，参与肿瘤发生。在肝细胞肝癌中，p27kip1是负性调节肿瘤发生与进程的重要蛋白。课题组前期研究发现p27kip1可发生O-GlcNAc修饰，进一步鉴定p27kip1的Ser2是其糖基化修饰位点。鉴于此提出p27kip1的O-GlcNAc修饰，调控p27kip1基因表达和影响HCC发生发展的假说。本课题拟先明确p27kip1能够发生O-GlcNAc修饰；接着分析p27kip1发生O-GlcNAc修饰后对磷酸化水平的影响及对磷酸化信号转导途径的影响；进一步分析p27kip1的O-GlcNAc修饰对肝癌细胞的增殖和恶变的影响；最后分析干预p27kip1的O-GlcNAc修饰在HCC发生发展中的意义。本项目研究为阐明HCC的发生机制，寻找HCC治疗靶点提供理论依据和方法支持。

在HCC的发生及发展过程中，肝癌细胞失去糖异生的能力，脂质及氨基酸代谢中糖原转化能力下降，细胞内无氧氧化的水平显著异常，其可促进HCC的发生及发展。研究p27kip1发生O-GlcNAc修饰后对磷酸化水平及磷酸化信号转导途径的影响，进一步分析p27kip1的O-GlcNAc修饰对HCC的增殖和恶变的影响。p27kip1在HEK293T及HepG2、Huh7细胞株中存在O-GlcNAc修饰；在PUGNAc及高糖刺激下，全细胞蛋白及p27kip1 的糖基化水平升高。OGA表达的下调可引起全细胞蛋白及p27kip1 的糖基化水平升高。PUGNAc处理HepG2细胞，随着 p27kip1 的糖基化水平增高，p27kip1 Ser10磷酸化水平亦增高。此外，我们发现2、106、110、157、198号位的丝氨酸/苏氨酸为其糖基化位点。进一步的研究发现Ser2糖基化位点突变显著降低Ser10磷酸化水平。 血清饥饿释放实验模型中，p27kip1蛋白随着细胞周期的进展由细胞核向胞浆转位。此外，p27kip1Ser2突变载体（p27kip1-S2A）与野生型相比，抑制了p27kip1的出核与胞浆定位，并且p27kip1-S2A与CRM1相互作用减弱。 p27kip1Ser2糖基化突变体与野生型相比，其对CyclinE/CDK2复合物的结合及抑制作用增强。当p27kip1发生糖基化修饰后，HepG2细胞增殖能力明显增强。HCC组织中的p27kip1 O-GlcNAc修饰水平显著高于对应的癌旁肝组织；OGT的表达强度与肝细胞肝癌组织分化程度、Ki-67的表达有统计学意义；p27kip1的亚细胞定位与肝细胞肝癌组织分化程度、肿瘤大小、Ki-67的表达有统计学意义；Kaplan-Meier分析显示OGT在肝细胞肝癌中的高表达及p27kip1的胞浆定位与患者总生存率的降低显著相关。p27kip1具有O-GlcNAc修饰，且p27kip1Ser2糖基化水平参与调节其Ser10磷酸化水平，进一步影响Ser10磷酸化信号转导途径。 糖基化水平促进p27kip1的细胞浆定位，解除p27kip1对细胞核内CyclinE/CDK2复合物的抑制作用，促进HCC细胞增殖；p27kip1O-GlcNAc修饰参与调控HCC的发发展，可能为HCC的治疗提供了一个潜在的靶点。