基于RcsA调控途径的苯乳酸抑制阴沟肠杆菌克拉酸合成的分子机制研究

The contamination of bacterial biofilms in food processing is closely related to food spoilage and the outbreak of some foodborne diseases. Enterobacter cloacae strains are dominant spoilage bacteria in slaughter environment and carcass meat of livestock and poultry, and the polysaccharide of colanic acid is the most important component to maintain the biofilm structure of this strain. Previous studies based on phenotypic identification and transcriptome data suggested that 3-Phenyllactic acid (PLA) might inhibit the production of colanic acid by influencing the RcsA cascade regulation pathway (sRNA →global regulation factor HNS →regulatory factor RcsA →colanic acid synthesis wca gene cluster). According to this hypothesis, this project will first analyze the effect of PLA treatment on the regulation of each component at the transcription and translation levels. And then through gene knockout and gel retardation method, the regulation effect and regulation sites of HNS to rcsA as well as RcsA to wca will be determined. Finally, the sRNAs which the expression levels were decreased by PLA treatment and can regulate HNS mRNA translation will be unraveled by sRNA deep sequencing and bioinformatics prediction, and their function will be verified afterwards. Ultimately, the inhibition mechanism of biofilm colanic acid synthesis by PLA treatment will be clarified. The results will provide new research ideas and basis for the inhibition of foodborne bacterial biofilm formation and facilitate the development of new biological preservatives.

食品加工中细菌生物膜的污染与产品腐败和一些食源性疾病的爆发密切相关。阴沟肠杆菌是畜禽屠宰加工环境和胴体表面的一种主要腐败菌，而克拉酸多糖是维持该菌生物膜结构的最主要成分。申请者前期通过表型鉴定和转录组数据发现苯乳酸可能通过影响RcsA级联调控途径（sRNA→全局调控因子HNS→调控因子RcsA→克拉酸合成wca基因簇）来控制克拉酸的合成。本项目针对该假设，首先分析苯乳酸处理对该调控途径中相关组件在转录和翻译水平的影响，然后通过基因敲除与凝胶阻滞确定HNS对rcsA、RcsA对wca的调控作用和作用位点，最后通过sRNA深度测序和生物信息学预测等筛选苯乳酸处理时表达量下降且调控HNS mRNA翻译水平的sRNA，并对其功能进行验证；最终阐明苯乳酸抑制该菌生物膜克拉酸合成的分子机制。研究成果将为食源性细菌生物膜的控制和新型生物防腐剂的开发提供新的研究思路和基础。

食品加工中细菌生物膜的污染与产品腐败和一些食源性疾病的爆发密切相关。阴沟肠杆菌是畜禽屠宰加工环境和胴体表面的一种主要腐败菌，而克拉酸多糖是维持该菌生物膜结构的最主要成分。亚抑菌浓度的苯乳酸能够在不显著影响菌体生长的前提下，显著抑制E. cloacae生物膜中胞外多糖的含量。苯乳酸处理显著降低了克拉酸合成（wca）基因簇中所有基因的表达，并且Rcs系统中rcsA基因的表达量显著降低，说明苯乳酸通过调控rcsA基因的表达抑制了生物膜多糖的合成。体外重组表达了全局调控因子-类组蛋白HNS蛋白和RcsA蛋白，通过表面等离子体共振技术（SPR）发现HNS可以特异性紧密结合rcsA基因启动子，RcsA蛋白可以特异性紧密结合wca基因簇启动子，说明E. cloacae克拉酸合成过程中RcsA级联调控途径中相关组件（类组蛋白HNS、rcsA、克拉酸合成（wca）基因簇）具有顺序调控作用。苯乳酸对E. coli K12的生物膜的形成也有明显抑制作用，由蛋白组和转录组测序发现苯乳酸处理使得胞内基因表达发生了显著性变化，如MarR蛋白上调，激活因子GadE、反转运蛋白GadC下调，β-内酰胺抗性上调，蛋氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、酪氨酸、丝氨酸和苏氨酸的代谢下调。相关基因的显著性表达影响了菌株的生物过程（如氧化还原过程、代谢合成过程等）、分子功能（耐酸性、耐药性、群体感应等）、细胞组分（结合蛋白、转运蛋白、各种酶类、核糖体相关蛋白等），进而减少了生物膜的形成。最后，为了更好的发挥苯乳酸的抗菌特性，制备了明胶/壳聚糖/3-苯基乳酸（PLA）抗菌纳米纤维膜。PLA的加入改善了纳米纤维的微观结构，并且提高了纳米纤维膜（GCP-1、GCP-2、GCP-3和GCP-4）的抗菌效果,可以用作活性食品包装。研究成果将为食源性细菌生物膜的控制和新型生物防腐剂的开发提供新的研究思路和基础。