核心转录因子Runx2调控小鼠牙釉质生物矿化及分子机制研究

RUNX2 gene mutations can lead to cleidocranial dysplasia (CCD) with abnormal tooth development. Runx2 is the only disease genes of CCD, and previous studies have shown that Runx2 l knockout ameloblast in mice exhibit enamel biomineralization defects, it is in accordance with literature reports of CCD patients with enamel hypoplasia, but it is still to be explored for molecular mechanism of Runx2 on enamel biomineralization. This project intends to make the following studies: (1) the morphology research methods are applied to observe the enamel biomineralization; (2) analysis of gene expression profile of mutant mice and control mice, to search for and establish the Runx2 downstream gene; (2) establish the activation or inhibition areas on the promoter of downstream target gene by Runx2 ; Using bioinformatics tools to predict promoter on the characteristic DNA sequence, and using the fixed point mutation to confirm the relation of characteristic sequence and Runx2; 3）Gel migration and chromosome immune coprecipitation is used to determine Runx2 interacting with target genes; （4） (5) the use of transgenic mice for target gene to make the target gene expressed in ameloblasts with Runx2 knockout gene to rescue enamel phenotype for mice. This project will help to clear the molecular mechanism of enamel development, and provide new ideas for the treatment of the related diseases.

RUNX2基因突变导致的锁骨颅骨发育不全综合征（CCD）伴牙齿发育异常。Runx2是CCD的唯一致病基因；前期研究表明小鼠成釉细胞中Runx2基因敲除导致釉质矿化障碍，这与CCD病人伴釉质发育不良的报道一致，但作用机制不清。本项目拟进行一下研究：（1）应用形态学研究方法观察牙釉质生物矿化；（2）分析突变鼠与对照鼠的基因表达谱，寻找、确立Runx2下游基因；（2）确立下游靶基因启动子上的Runx2激活区或抑制区；利用生物信息工具预测启动子上特征性DNA序列，利用定点突变明确特征性序列和Runx2相互作用；（3）利用凝胶迁移和染色体免疫共沉淀法验证特定转录因子与靶基因相互作用；（4）利用靶基因转基因小鼠，使靶基因在Runx2基因敲除小鼠成釉细胞中过表达进行挽救釉质表型。本项目有助于明确釉质发育的分子机制，并为相关疾病的治疗提供依据和新思路。

牙釉质发育不全是临床上常见的遗传性疾病，但病因及分子作用机制仍未阐明。釉质发育分为分泌期、转型期和成熟期。在釉质发育过程中，分泌期成釉细胞合成、分泌釉质基质蛋白成分，形成釉质的基本形态；在釉质成熟期，成釉细胞利用其形成的基膜附着于牙釉质表面，降解吸收牙釉质基质蛋白，并将大量的矿物质转运至牙釉质。釉质基质蛋白的合成、分泌异常，或降解、吸收异常，或釉质矿物质转运异常，均可导致釉质发育缺陷。目前釉质基质蛋白基因表达的分子调控机制仍不清楚。Runx2是引导骨组织生物矿化的核心转录因子，Runx2基因缺失可导致骨发育异常，表现为成骨细胞缺失，骨组织发育停止。本项目观察了Runx2转录因子对牙釉质生物矿化的影响，并探讨了其在调控牙釉质蛋白合成、分泌和降解吸收中的作用。我们发现：1.小鼠上皮细胞中敲除Runx2基因导致成熟期牙釉质矿化程度显著下降，表现为釉质中大量牙釉质基质蛋白的残留，易磨耗；成熟期成釉细胞由短柱状细胞变为扁平状上皮细胞。在Runx2敲除小鼠成釉细胞中再表达外源性Runx2使牙釉质的磨耗减轻，改善了牙釉质矿化程度。2.利用成釉细胞系体外研究Runx2对牙釉质矿化相关基因表达的影响发现：Runx2与釉质蛋白吸收相关因子Wdr72基因和釉质表层蛋白Amelotin基因的启动子特定DNA序列相互作用促进了Wdr72和Amelotin启动子的转录活性和基因的表达。3.小鼠上皮细胞中敲除Runx2基因导致牙周结缔组织破坏和牙槽骨吸收，结合上皮向根方迁移。4.细胞钙粘附蛋白和细胞紧密连接蛋白参与了上皮细胞的屏障作用，牙龈上皮/结合上皮Runx2基因缺失导致细胞钙粘附蛋白E-cadherin和细胞紧密连接蛋白Jam1基因表达下降，致使结合上皮细胞间隙增加，加速了牙周组织的破坏。本项目研究结果表明：1.Runx2通过参与成釉细胞矿化相关基因的表达，调控成熟期牙釉质的生物矿化过程；2.Runx2通过调控牙龈上皮细胞/结合上皮细胞的E-cadherin和Jam1基因的表达参与了牙周组织上皮屏障的形成。因此Runx2不仅在牙釉质成熟过程中起核心作用，在牙周组织上皮屏障形成过程中也起到关键作用。