釉质发育过程中Odaph（牙齿发生相关磷蛋白）生物学功能的研究

Odaph is a newly reported enamel matrix protein. The gene mutation in human can lead to enamel dysplasia. In our previous study, Odaph was mainly expressed in enamel maturation stage, and distributed in the outer layer of enamel and the basement membrane（a layer of extracellular matrix between the distal end of ameloblasts and enamel). In order to investigate the biological roles of Odaph in enamel development, this project aims to: (1) taking the Odaph gene knockout /LacZ gene knockin mice constructed by our group as a study model, we will analyze the changes of enamel structure and periodontal tissues in Odaph gene knockout mice by means of morphology, histology, and cell biology to clarify the relationship between Odaph gene deletion and enamel hypoplasia and periodontitis in mice; (2) observing the formation of apatite crystal and mineralized nodules induced by Odaph with the methods of cell biology and molecular biology to determine the roles of Odaph in enamel biomineralization in vitro; (3) by exogenous Odaph overexpression in ameloblasts of mature enamel in mice to determine the role of Odaph in inducing enamel biomineralization in vivo. This project will further enrich the theoretical system of dental enamel development and provide new ideas for the regeneration of dental enamel and prevention of periodontitis.

Odaph是一种新近报道的釉质基质蛋白；在人类该基因突变导致牙釉质发育不全。本课题组前期研究表明Odaph主要在釉质成熟期表达，分布于牙釉质外层和基膜（成釉细胞远端与釉质层之间的一层胞外基质成分）。为了探讨Odaph在釉质发育中的生物学作用，本项目拟：（1）以课题组构建的Odaph基因敲除/LacZ基因敲入小鼠为研究模型，利用形态学、组织学和细胞生物学等研究手段分析Odaph基因敲除小鼠牙釉质和牙周组织的变化，明确Odaph基因缺失与牙釉质发育不全和牙周组织炎症发生的关系；（2）利用细胞生物学和分子生物学方法观察Odaph诱导磷灰石结晶和矿化结节的形成，明确体外Odaph在釉质生物矿化中的作用；（3）通过外源性Odaph在小鼠成熟期成釉细胞中过表达，明确体内Odaph诱导釉质生物矿化的作用。本项目研究拟进一步丰富牙釉质发育的理论体系，为临床上牙釉质的再生和牙周病的预防提供新思路。

牙齿发生相关磷蛋白ODAPH是一种新近报道的釉质基质蛋白。在人类该基因突变导致牙釉质发育不全。本研究探讨了ODAPH在体内釉质发育过程中的表达；通过构建Odaph-null/lacZ-knockin小鼠，研究了ODAPH在釉质发育过程中的作用。结果表明，ODAPH蛋白在成熟期呈特异性时空表达，是成熟期成釉细胞远端出现的非典型基膜的新的组成成分。Odaph基因敲除小鼠在成熟期出现釉质基质蛋白残余，釉质矿化不良。在釉质成熟期阶段，成釉细胞与牙釉质基质分离，连接成釉细胞与釉质表层的非典型性基膜的连续性遭到破坏。提示ODAPH可能通过破坏基膜侧成釉细胞与牙釉质之间的附着，从而影响成熟期牙釉质矿化。此外，Odaph基因敲除小鼠牙周出现结合上皮与根面的剥离，结合上皮细胞过度增殖，牙周纤维排列紊乱。.为进一步研究ODAPH对釉质矿化的影响，课题组构建了釉原蛋白启动子驱动的Odaph过表达小鼠，研究其对成釉细胞形态，釉质基质分泌以及釉质矿化的影响。通过构建体外Odaph过表达慢病毒转染小鼠成釉细胞系进一步证实ODAPH对矿化的作用。Odaph过表达小鼠牙釉质呈不透明的白垩色表现，牙尖磨损和牙釉质剥脱更为严重；扫描电子显微镜发现釉质表面粗糙不平，釉质剥脱面发生在釉质牙本质交界处，完全失去棱柱状的釉柱结构。uCT表明釉质厚度明显降低且分布不均，釉质矿化程度在成熟期降低而在分泌期增强。成釉细胞呈空泡状的病理形态，稀疏且不规则排列，釉质厚度降低，釉质着色不均一，成釉细胞与牙釉质界面不规则。透射电子显微镜发现成釉细胞失去正常托姆斯突形态，伴随少量无釉柱结构的釉质形成，大部分内质网呈应激状态。免疫组织化学检测AMELX在胞浆中弥漫表达，而在釉质基质中表达量较低，矿化相关蛋白ALPL以及RUNX2表达量均升高。体外构建Odaph过表达的成釉细胞系模型，通过qRT-PCR和免疫荧光共同验证了Odaph过表达后矿化相关基因Runx2以及Alpl表达均上调。结果提示ODAPH在成釉细胞中过表达通过诱导分泌期牙釉质异常矿化而破坏牙釉质形成。.本项目研究进一步丰富了牙釉质发育的理论体系，为临床牙釉质再生和牙周病预防提供新思路。