TGF-beta1调控成釉细胞MMP-20基因转录活性的分子机制研究

基质金属蛋白酶-20（MMP-20）在牙齿组织中呈特异表达，与牙釉质疾病发生有密切关系。研究表明TGF-beta1上调MMP-20基因表达。我们拟进一步研究TGF-beta1-MMP-20信号通路中MMP-20基因转录活性的分子调控。本项目拟以小鼠成釉细胞为研究模型，在TGF-beta1-MMP-20信号通路中，从基因转录调控水平上，寻找MMP-20基因启动子的特征性序列以及与之相互作用的转录因子：我们拟运用分子克隆、细胞转染等技术，通过双荧光素酶报告基因检测系统分析MMP-20基因启动子特征序列；运用免疫组织和细胞化学、DNA亲合沉淀、染色体免疫共沉淀等技术，寻找TGF-beta1-MMP-20通路中与MMP-20启动子特征性序列相互作用的转录因子；利用分子克隆、基因转染、免疫印迹等技术，进一步确立相关转录因子在TGF-beta1-MMP-20 信号通路中的生物学作用。

牙釉质矿化与龋病发生有着十分密切的关系。在人类，基质金属蛋白酶-20（MMP20）基因突变可导致牙釉质矿化不良。转化生长因子-β（TGF-β）家族成员广泛参与了牙齿组织的形成过程。在本课题立项之前，我们发现TGF-β1具有促进成釉细胞MMP20基因表达的作用（THE ANATOMICAL RECORD 292:885–890，2009），而且TGF-β1显著上调MMP-20基因启动子的转录活性（牙体牙髓牙周病学杂志 19:251-255，2009）。在这些研究基础上，本项目通过体内外实验对TGF-β1调控成釉细胞中MMP20基因表达的分子机制进行了广泛而深入的研究，在本专业中文核心期刊发表论文8篇（包括已录用文章）。另外本研究小组已将其他一些研究结果撰写成2篇英文论文，目前已投稿至国际英文期刊。该项目获得的主要研究结果及结论如下：⑴利用分子克隆技术获得不同长度小鼠MMP20基因启动子，利用双荧光素酶报告系统研究首次发现小鼠MMP20启动子多个区域存在在TGF-β1反应区；利用生物信息工具分析TGF-β1反应区，在MMP20启动子上发现与TGF-β1信号通路有关的数个转录因子潜在结合位点，包括ap-1潜在结合位点、runx2潜在结合位点、ap-2潜在结合位点等。⑵利用分子生物学技术对特定位点进行定点突变，制备MMP20启动子不同的突变体，利用双荧光素酶报告系统进行分析后发现ap-1、 runx2等潜在结合部位突变后，小鼠MMP20启动子转录活性降低。⑶染色体免疫共沉淀实验进一步表明：ap-1、 runx2等与MMP20启动子上特定的DNA序列相互作用。⑷利用免疫组织化学技术对小鼠发育期牙齿进行研究发现：ap-1和 runx2在牙釉质成熟期的成釉细胞中表达显著。⑸以体外培养的成釉细胞为模型，发现ap-1、 runx2等均介导MMP20基因表达。⑹通过研究MAPK信号通路和SMAD信号通路，我们发现，SMAD通路与MAPK通路是TGF-β1调节MMP20基因表达的主要通路。p38 MAPK/runx2信号通路促进TGF-β1诱导的MMP20基因表达；JNK/AP-1信号通路抑制TGF-β1诱导的MMP20基因表达。