TGF-β1/TGFBR1调控釉成熟蛋白（Amelotin）表达的分子机制

既往研究表明，釉成熟蛋白（Amelotin）参与并调控釉质生物矿化。本小组研究发现 ：TGF-β1诱导Amelotin表达，成釉细胞中存在TGF-β1/TGFBR1-Amelotin信号通路。本项目拟：①从该通路的起点出发，通过免疫细胞化学、免疫印迹以及实时定量RT-PCR等研究方法，寻找参与该通路主要信号分子；②从该通路的终点出发，利用生物信息工具分析Amelotin启动子，利用双荧光素酶报告基因检测系统寻找其转录活性激活区，并利用凝胶迁移、染色体免疫共沉淀和Amelotin启动子定点突变等研究方法，确立该通路中Amelotin启动子的特征性DNA序列和与之相互作用的转录因子；③在上述研究基础上，利用基因过表达和RNA干扰等细胞生物学和分子生物学方法，进一步确立该通路中上游信号分子、下游转录因子以及Amelotin表达三者之间的关系。本项目研究将进一步揭示牙釉质发育的分子调控机制。

Amelotin是新发现的一种牙釉质基质蛋白，在牙釉质矿化，特别是釉质表层矿化中发挥了重要作用。本项目通过体内外实验对TGF-beta1调控釉成熟蛋白Amelotin（Amtn）基因表达的机制进行了研究：.1、Amtn基因启动子的TGF-beta1反应区域存在Smad3和Runx2结合位点。⑴TGF-beta1激活Amtn启动子转录活性。TGF-beta1反应区内转录因子主要包括Smad3和Runx2潜在结合位点。（2）Smad3结合位点突变后小鼠Amtn启动子的转录活性显著下降，而Runx2结合位点突变后启动子活性下降不明显。（3）ChIP和EMSA实验表明：Smad3和Runx2均与Amtn启动子上特定的DNA序列相互作用。.2、TGF-beta1-Smad3信号通路上调Amtn基因表达。（1）从釉质分泌期到转型期，p-Smad3在成釉细胞核中表达逐渐增强，但在釉质成熟期，p-Smad3表达轻度下降。（2）双荧光素酶报告系统研究表明：Smad3上调Amtn基因转录活性与Smad3剂量呈正相关；在Smad3位点突变后，Smad3对Amtn基因启动子作用显著降低。（3）在Tgf-beta1存在条件下，体外培养的成釉细胞中加入TGFBR1抑制剂后，成釉细胞胞核中Smad3下降以及Amtn基因表达下降；外源性Smad3促进了成釉细胞Amtn基因表达。.3、Mapk信号通路介导TGF-beta1上调Amtn基因表达。（1）Tak1在分泌期成釉细胞胞浆和胞核中均有表达；Jnk和p38Mapk主要在成釉细胞胞核中表达。（2）在Tak1阻断剂、Smad阻断剂、Jnk阻断剂或p38 Mapk 阻断剂存在条件下，Tgf-beta1失去上调Amtn基因表达作用。（3）活化型Tak1小鼠研究发现，Tak1通过p38Mapk通路而非Jnk通路显著上调Amtn基因表达。 .4、TGF-beta1通过Runx2抑制Amtn基因表达。（1）Runx2在分泌后期成釉细胞中开始表达，在釉质转型期表达显著增强。（2）TGF-beta1上调Runx2基因表达；在敲除Runx2的小鼠成釉细胞，Amtn基因表达水平明显提高。（3）双荧光素酶系统研究表明：Runx2通过非Runx2结合位点抑制Amtn启动子的转录活性。