恶性胶质瘤发生、侵袭过程中Brevican的作用及其机制的研究

短蛋白聚糖(Brevican)是近年来新发现的一种中枢神经系统特有的硫酸软骨素蛋白聚糖，是脑内最丰富的细胞外基质（ECM）成份之一，在恶性胶质瘤发生时呈特异的高度表达。通常情况下，神经系统的ECM由不利于细胞迁移的透明质酸(HA)等构成骨架,是中枢神经细胞生长、迁移的屏障。但是，胶质瘤发生时，与HA结合的Brevican却表达上调，并促进了胶质瘤的侵袭、蔓延生长；目前Brevican的具体作用及机制尚未明确。本研究采用免疫组织化学技术、模式生物斑马鱼的移种肿瘤以及胶质瘤细胞系RNA干扰等手段，对不同恶性程度的胶质瘤组织中Brevican表达情况分析、斑马鱼胶质瘤形成过程进行全程实时监控、细胞Brevican基因干扰后粘附、侵袭能力改变等进行研究，以阐明Brevican在胶质瘤形成中的具体作用及其与恶性程度、侵袭之间的关系，为明确Brevican作为胶质瘤的肿瘤标志以及胶质瘤的防治奠定基础。

本课题首系统地检测了Brevican分子在脑胶质瘤及良性对照组（脑膜瘤和无激素垂体瘤）中的表达特征，揭示了Brevican表达与脑胶质细胞瘤之间存在的关联，特别是其与病理分级、分化程度和侵袭程度的关系。我们发现，Brevican的表达主要定位于胶质瘤细胞的细胞浆和细胞周围即细胞外基质中，弥漫表达，呈均质状或细颗粒状。在良性对照组中表达量（22.5%，9/40）很低，而在胶质瘤中表达水平则较高，阳性率可达68.3%（41/60），而且随着胶质瘤恶性程度（从I级的毛细胞型胶质瘤至IV级的胶母型胶质瘤）的提高，其阳性率逐级增高，且免疫组化的阳性积分也逐级升高。建立了Brevican稳定过表达igzbiaoda下调的U251-Brevican（“TU251细胞”）和293T-Brevican细胞株。实验发现U251-Brevican表达上调细胞的迁移能力明显增强。同时在Brevican knockdown的细胞，CCK-8和克隆形成试验均证明其增殖能力下降；细胞免疫荧光显示细胞之间的伸展能力下降，进一步通过损伤修复试验（Wound-healing assay）也证实其蔓延能力明显较对照组降低；穿透Marigel的能力也变弱。研究发现，在Brevican表达抑制的TU251细胞被EGF激活后，Erk1/2、JNK磷酸化水平都由于Brevican的表达下调而低于相应对照组的TU251-ShDNA mock细胞，表明Brevican参与了对MAPKs磷酸化的调节；同时，我们的实验也表明，Brevican knockdown 细胞中Akt的磷酸化水平也明显低于对照的TU251-ShDNA mock细胞。这很有可能是通过上游的Akt信号通路活性受到抑制而起作用。建立了Brevican抑制表达的细胞（TU251- pSuper- ShDNA 2 细胞）和对照组（TU251-pSuper-ShDNA mock、TU251未处理）细胞株，通过皮下接种，观察、比较这两组之间致瘤性的差别。脑胶质瘤动物体内成瘤实验表明， RNA干扰后，Brevican表达下调，Brevican蛋白水平降低与胶质瘤的形成、扩展的密切密切相关。本课题的研究成果表明，Brevican有望成为有效的脑胶质细胞瘤诊断标记物和基因治疗靶点。