金丽假交替单胞菌中密度感应淬灭酶及其生理功能研究

N-acyl-homoserine lactones (AHLs)-dependent quorum sensing (QS) is closely related with virulence factor production in many bacterial pathogens. Quorum quenching (QQ), the enzymatic degradation of the signaling molecule could interfere QS pathways of pathogens to attenuate or disarm the virulence. In this project, the heterologous expression and purification of the two QQ enzymes, i.e. AHL acylases encoded in Pseudoalteromonas flavipulchra JG1 will be carried out, the products of AHLs degraded by the recombinant enzymes and the specificity of the substrates will be investigated; catalytic efficiency for AHLs by the AHL acylases will be detected, and their enzymatic properties will be explored and compared; the catalytic active centers will be confirmed, the environmental factors which impact the expression of the enzymes will be tested, and their AHL-degrading mechanisms will be investigated; the impact of AHL acylases on the growth and bioactivities of JG1, as well as the regulation of protein expression in JG1 will be revealed, and their physiological functions will be determined. Based on the above studies, the understanding of QQ activity in marine bacteria will be expanded, which will provide further insight into the application of novel antivirulence strategy in aquaculture.

N-酰基高丝氨酸内酯（N-acylhomoserine lactone, AHL）依赖的密度感应（quorum sensing, QS）与许多致病菌毒力因子的表达密切相关。密度感应淬灭作用（quorum quenching, QQ）通过降解AHL类信号分子，阻断致病菌的QS通路，从而降低或完全抑制其致病性。本项目拟对金丽假交替单胞菌JG1中的2个QQ酶—AHL酰基转移酶进行异源表达及纯化，分析重组酶催化AHL后的降解产物及底物特异性；检测其对AHL的催化效率，揭示其酶学性质并比较两者的异同；分析其催化活性中心并检测不同环境因子对其表达量的影响，探究其对AHL类信号分子的降解机制；比较AHL酰基转移酶差异表达对菌株JG1生长、生物活性及蛋白表达调控的影响，阐明其在菌株JG1中的生理功能。通过以上研究，拓展对海洋细菌中QQ作用的认识，为水产养殖病害的新型环境友好型防治手段的开发应用奠定基础。

金丽假交替单胞菌JG1具有密度感应淬灭活性，在其基因组中发现存在有2个潜在的新型密度感应淬灭酶基因pfmA和pfpA。通过对这两个基因进行序列分析，发现其与已知的AHL酰基转移酶蛋白序列一致性均不超过35%，且其均属于盘尼西林G 酰基转移酶家族，具有N端水解酶超家族的典型特征，即蛋白表达后经过翻译后修饰可形成两个亚基。根据基因序列成功构建了异源表达菌株并获得了纯化的重组蛋白，对其酶学活性进行检测，结果表明这两个蛋白均为AHL酰基转移酶，能够断裂C12-HSL的酰胺键形成产物HSL。PfmA和PfpA蛋白的最适反应温度分别为30℃和40℃，最适pH值均为7.0。SDS能够使PfmA和PfpA完全失活。PfmA和PfpA蛋白均对长链的AHL信号分子具有降解活性，但两者的底物范围略有差异，PfmA能降解C10-HSL而PfpA不能。PfmA不能降解盘尼西林G，但可以降解氨苄盘尼西林。高度保守的Ser256是PfmA的催化活性位点。PfmA能够降低铜绿假单胞菌的毒力因子胞外蛋白酶和绿脓菌素的分泌，又可提高被铜绿假单胞菌侵染的卤虫的存活率。在菌株JG1培养液中添加C12-HSL能够促进JG1生长量增加，提高生物被膜产量，基因pfmA表达量上调，pfpA表达量下调，但对菌株的还原糖利用情况、几丁质酶活以及抑菌活性没有影响。通过转录组和蛋白质组测序及分析，菌株JG1中与氨基酸转运和代谢、转录和翻译、信号转导、无机铁的转运和代谢相关的功能基因表达量较高，表明菌株JG1具有活跃的代谢特征及对外界环境变化快速响应的能力。通过基因的差异表达分析，添加信号分子C12-HSL显著影响了菌株JG1的乙醛酸循环，转录组和蛋白质组分析均检测到苹果酸合酶的表达量受到显著抑制，并通过体外实验验证了在添加信号分子的条件下菌株JG1中苹果酸合酶和乌头酸水合酶的活性显著降低。由此可知，尽管菌株JG1不产生信号分子，但其体内的AHL酰基转移酶能够降解外源的AHL信号分子，从而影响菌株的生长代谢过程。对菌株JG1中AHL酰基转移酶生理功能的研究有助于进一步为密度感应淬灭技术应用于水产养殖业病害防控奠定理论基础。