四型分泌系统在艰难梭菌中的多态性及其与A、B毒素外排关联性的研究

Clostridium difficile is a Gram-positive anaerobic bacterium that is the major cause of nosocomial antibiotic-associated diarrhea, leading to significant morbidity and mortality and placing a considerable economic burden on healthcare systems. To face the new thereat from C. difficile, a serial of genomic and molecular research have been performed. However, research has focused largely on two toxins (Toxin A and Toxin B), and their mode of secretion from the bacteria is poorly understood. Type IV secretion system (T4SS) is a versatile secretion system essential for the virulence of several bacteria species, and they enable the secretion of protein and DNA substrates across the cell envelope. To greater understand the distribution and the diversity of T4SS in C. difficile, this project will address all polymorphism sites of T4SS genes among 100 C. difficile strains. Additionally, PCR sequencing, cell toxin experiment and animal experiment will be used in finding the relationship of T4SS polymorphisms and the virulent level of C. difficile, to open avenues for understanding pathogenic mechanism of C. difficile and find new molecular diagnostics targets for C. difficile detection.

艰难梭菌已逐渐成为成人腹泻、尤其是医院感染的重要病原菌之一，临床可引起伪膜性结肠炎，发生巨结肠或肠穿孔时，死亡率高达35-50%。存在于艰难梭菌和多种致病菌中的四型分泌系统（T4SS）可以将蛋白输送到寄主细胞，然而其是否参与艰难梭菌主要致病因子A、B毒素的外排尚未被了解，其与艰难梭菌致病性之间的关联性仍属空白区域。本项目组拟基于前期完成的T4SS数据库中的特异性片段，开发艰难梭菌中T4SS的PCR鉴定方法;针对不同来源、不同类型的100株艰难梭菌，鉴定T4SS的分布及其遗传多态性现象；继而利用艰难梭菌毒力水平检测金标准(动物肠袢实验和细胞毒素测定)，评估T4SS的存在及其多态性与A、B毒素外排之间的关联性，明确T4SS的多态性对艰难梭菌毒力水平的影响，为研究艰难梭菌的致病机制提供线索，为今后筛选艰难梭菌快速检测和毒力评估的靶标位点提供理论基础，对艰难梭菌感染的防治具有重要意义。

在本项目中课题组按计划完成了各项任务。艰难梭菌 （Clostridium difficile），是一种广泛存在于环境的革兰氏阳性菌，作为人与动物的膜性肠炎的主要致病菌，引发成人医院感染性腹泻，在世界各国广泛流行。我国人口众多，医疗资源有限，如不能对医院艰难梭菌感染进行有效控制，势必会造成更严重的公共卫生问题，增加医疗成本和经济负担。T4SS 是与细菌结合机制有关的一类分泌系统。该机制形成一个“注射器”结构与胞外相连，可以将毒素或蛋白输送到寄主细胞，直接导致疾病。IV 型分泌系统不但可以直接转运毒力蛋白质，还可以通过细菌间接合作用介导基因水平转移，传递毒力基因，导致病原体毒力增强，有利于致病菌的进化。然而，艰难梭菌中T4SS的分布情况，及其与致病性之间的关联性研究仍属空白区域。未弥补以上研究空白，本课题开展了以下研究，并获得如下结果。课题组与中日友好医院及其他合作单位共同建立了中国艰难梭菌临床菌种库，课题期间共筛查临床疑似艰难梭菌感染的病例1323例，分离并鉴定艰难梭菌菌株122株。所有菌株都经过生化鉴定，分子分型和毒素检测试验。在实验室检测方法方面，课题组对Jean-Louis Pons等建立艰难梭菌鉴定和毒素检测的多重PCR方法进行优化、改良并在实验室常规开展；开展了致病性艰难梭菌的核糖体分型方法，并建立核糖体分型的菌株图谱库。课题组基于高通量测序方法，对艰难梭菌基因组学和四型分泌系统进化学研究，并开展了027型艰难梭菌北京某院的院内爆发的溯源调查及相关研究，初步开展了艰难梭菌高致病流行株RT027的耐药分析。.项目期间，共培养研究生1人，发表本课题相关SCI文章7篇，建立并完善了四型分泌系统在线数据库和分析平台（http://www.secretion.org/），至2017年1月止，该数据库已纳入五万余条四型分泌系统相关基因数据，并进一步构建在线分析系统，使科研工作者可以通过鼠标点击的方式，方便快捷的完成对细菌基因组中四型分泌系统的有无和多态性等生物信息分析工作。