艰难梭菌毒素B(TcdB)受体蛋白的筛选及功能鉴定

As a gram-positive, spore-forming anaerobic bacillus, Clostridium difficile is responsible for severe and fatal pseudomembranous colitis, and poses the most urgent antibiotic resistance threat worldwide. Epidemic C. difficile is the leading cause of antibiotic-associated diarrhoea globally, especially diarrhoea due to the emergence of hypervirulent strains associated with high mortality and morbidity. C. difficile causes disease is mainly through its secretion of two toxic proteins: TcdA and TcdB. TcdB is proved to be the major virulence factor, which enters host cells through a poorly understood mechanism to elicit its pathogenic effect. We propose to identify the cellular receptor for TcdB through both shRNAmir library gene silencing screening and sgRNA library gene knockout screening, a newly developed technique by us using CRISPR/Cas9 system (Nature 2014). We have already obtained a candidate TcdB receptor, and we will finish the validation and characterization of this important target. Meanwhile, we propose to screen for the second receptor that also functions to mediate TcdB endocytosis. The success of this study will help deepen our understanding on the infectious mechanism of C. difficile, and provide insights for the development of host-oriented countermeasures against this deadly disease.

艰难梭菌(Clostridium difficile)通过分泌两种毒素蛋白（TcdA/B）致病，是全球范围导致抗生素相关腹泻和假膜结肠炎的主因。作为严重威胁公共生命安全的感染性疾病，艰难梭菌通过毒素侵染的机制还不十分清楚，这严重阻碍了有效治疗手段的研发。TcdB被证明是艰难梭菌致病的主要原因，而且它是通过受体介导进入到宿主细胞内部致病的，然后人们对该毒素受体几十年的寻找至今一无所获。我们计划利用shRNAmir基因沉默文库以及我们刚研发成功的基于CRISPR/Cas9系统的sgRNA基因敲除文库（Nature 2014），筛选TcdB的宿主细胞受体蛋白。我们初步结果已经获得候选的毒素受体，我们将使用多种手段证明寻找到的受体，以及继续筛选鉴定存在的第二个受体。这项研究将深化人们对艰难梭菌引起的感染性腹泻的发病机理的认识，并对发展新型治疗手段提供新的药物作用靶点。

艰难梭菌（Clostridium difficile）是一种厌氧的、能够形成孢子、寄生在哺乳动物肠道中的革兰氏阳性菌。艰难梭菌感染能够引起结肠炎、抗生素相关性腹泻、伪膜性肠炎甚至死亡。目前，艰难梭菌感染已经成为引起医疗相关感染的主要原因之一。艰难梭菌通过分泌两种毒素TcdA和TcdB对宿主细胞产生毒理伤害，其中TcdB是主要的毒力因子，但是其进入细胞内的受体不清，制约致病机制研究及药物靶点开发。.利用shRNAmir文库筛选、TALEN及CRISPR/Cas9介导的基因敲除等多种手段，我们首次发现艰难梭菌毒素B（TcdB）受体 –Chondroitin sulfate proteoglycan 4（CSPG4），并对其在感染过程中的功能进行了完整证明及机制研究。在此基础上，通过CRISPR筛选的方法，发现了TcdB的新受体Low density lipoprotein receptor-related protein 1（LRP1）。我们利用TALEN基因组编辑技术获得了LRP1-/-单克隆细胞，并发现CSPG4-/-/LRP1-/-细胞与CSPG4-/-细胞相比，对于TcdB的抗性增强，Rac1的糖基化速率也减慢，表明LRP1在介导TcdB进入细胞中起到关键作用。免疫沉淀实验表明全长LRP1蛋白也能够和全长TcdB蛋白存在相互作用，并且LRP1蛋白能够特异性地与TcdB的CROPs区域结合，提示存在双受体介导TcdB入胞的新机制。此外，我们首次证实艰难梭菌通过激活强自噬途径侵染宿主的机制，并阐明BECN1蛋白在细胞自噬中的独特作用。我们还发现了TcdB的糖基转移酶的活性能够触发细胞自噬介导的细胞生长抑制。.TcdB毒素是艰难梭菌感染中最为重要的致病因子，人们对其受体的寻找持续了超过三十年，我们的研究发现了CSPG4和LRP1两类重要受体，并对其介导TcdB入胞的机制进行了深入探索，这些结果将为理解艰难梭菌感染的致病机制和治疗靶点的发现提供重要依据。受该基金支持，我们还建立了一系列高通量基因编辑技术平台，包括首次建立长链非编码RNA的高通量筛选技术等，为感染性疾病的功能基因组学提供了有力工具。发表与基金支持相关的SCI论文10篇，其中包括Nature Biotechnology、Cell Research、Nature Communications等高影响因子论文。