缺氧环境下Ring1B和SET8协同调控Twist介导的上皮-间质转换在胰腺癌转移中的作用和机制研究

Epithelial-mesenchymal transition (EMT) plays a crucial role in the development and progression of pancreatic cancer which is characterized by highly aggressive due to its early metastasis. Transcriptional factor TWIST was essential to promote EMT and tumour-initiating capability. However, the expression of TWIST in pancreatic cancer still was unclear. Our preliminary study showed that TWIST was overexpressed in distal pancreatic cancer invading splenic artery and was associated with the worst prognosis, which might be activated by hypoxic microenvironment. Endogenous Ring1B and SET8 interact with overexpressed TWIST in pancreatic cancer cell lines after exposure to hypoxia, and simultaneous depletion of Ring1B or SET8 compromises TWIST-mediated transcriptional regulation. We hypothesised that Ring1B and SET8 acted as epigenetic modifier on the promoters of the hypoxic TWIST target genes E-cadherin or N-cadherin via its H2AK119 monoubiquitination and H4K20 monomethylation，respectively. Thus，the aims of our application are to investigate the role of TWIST-promoted EMT and evaluate the potentials of TWIST as novel target for intervention of the metastasis of pancreatic cancer.

上皮-间质转换（EMT）在胰腺癌转移中发挥重要作用。TWIST作为诱导EMT的重要因子，是连接多种促肿瘤转移信号通路的中心分子，其诱导EMT的机制仍不清楚。目前TWIST在胰腺癌中表达尚不明确。我们前期研究发现，TWIST在脾动脉浸润型胰体尾癌中的表达较非浸润型显著升高且与预后差相关；TWIST表达升高与肿瘤缺氧环境形成相关。检测低氧处理的胰腺癌细胞发现，内源性TWIST表达升高，且与Ring1B和SET8特异结合，沉默Ring1B和SET8可以削弱TWIST对靶基因的转录调控作用。由此推测: 由肿瘤缺氧诱导的TWIST能招募Ring1B和SET8至靶基因启动子区，通过Ring1B介导组蛋白H2AK119单泛素化，协同SET8介导H4K20单甲基化，调控基因表达并诱导EMT。本课题拟深入探讨TWIST在EMT过程中的表观调控机制，评估TWIST作为抗肿瘤转移靶点的潜在可能性，转化研究成果。

上皮-间质转换（EMT）在胰腺癌转移中发挥重要作用。TWIST作为诱导EMT的重要因子，是连接多种促肿瘤转移信号通路的中心分子，其诱导EMT的机制仍不清楚。我们通过对90例胰腺导管腺癌标本进行免疫组化检测，利用不同胰腺癌细胞系开展体内外实验进行验证，发现TWIST和缺氧诱导因子 HIF-1α在脾动脉浸润型胰体尾癌内表达上调，同时伴随着EMT标志物（E-cadherin）和细胞周期相关蛋白P16的下降。上调的TWIST表达与更差的胰腺癌预后相关。体外实验证实HIF-1α介导的高表达的TWIST能够通过与辅转录因子EZH2和Ring1B相互作用，共同促进胰腺癌细胞的生长和EMT。体内实验证实在缺氧环境下，TWIST高表达能够促进肿瘤模型的生长、转移，并且缩短肿瘤模型小鼠的生存期；然而敲除Ring1B或者EZH2，则能够抑制肿瘤模型的生长和转移，并且延长小鼠生存期。综上所述，TWIST能够通过与EZH2和Ring1B相结合来调控E-cadherin和P16的表达，从而促进胰腺癌的生长和转移。此外，我们发现长链非编码RNA Anril是Ring1B和EZH2的结合分子。建立了老鼠模型以及过表达和下调ANRIL的质粒并进行细胞转染。通过过表达ANRIL，EMT标志物以及ATM-E2F1信号通路的标志物发生明显改变。通过Transwell实验以及划痕实验来检测细胞的侵袭和迁徙能力，过表达ANRIL能够增强胰腺癌细胞的侵袭和迁徙能力。在胰腺癌细胞和小鼠模型中，下调ANRIL能够上调INK4B,INK4A, ARF和E-cadherin的表达，同时降低N-cadherin和Vimentin的表达。过表达ANRIL能够下调INK4B,INK4A, ARF和E-cadherin的表达，同时升高N-cadherin和Vimentin的表达。在胰腺癌细胞中抑制ATM-E2F1通路，E-cadherin表达降低同时N-cadherin和Vimentin的表达升高。在沉默ANRIL或者抑制了ATM-E2F1通路之后，胰腺癌细胞侵袭和转移能力下降。最后，我们发现HIF-1α是内质网驻留蛋白1（RER1）的上游调节因子，并且胰腺癌组织和癌旁组织中RER1的表达水平显著差异，并且RER1表达与与胰腺癌总体生存率相关。我们证实了RER1在胰腺癌发生和转移中的重要功能，通过敲减RER1能够抑制胰腺癌细胞