古菌DNA磷硫酰化修饰系统的研究

DNA phosphorothioate (PT) modification, in which the non-bridging oxygen in the sugar-phosphate linkage is replaced by sulfur, is the first reported physiological modification in the DNA backbone. PT modification occurs in sequence-selective and Rp stereo-specific manner in diverse bacteria. However, the previous studies of DNA PT modifications mainly focused on bacteria. The sequence comparison indicates that homologous dnd gene clusters are present in archaea. In our preliminary study, we have detected PT modifications in several archaeal genomic DNA samples by LC-MS/MS. As one cellular life form of the three-domain system, archaea possess unique genetic features. In this study, we will first analyze the PT features in archaea. We also aim to study the mechanism of DNA PT modification in archaea to further understand this unusual modification. We will then map genomic PT sites in archaea and compare the global transcriptome to identify the role of PT modifications in gene regulation and cell physiology. Meanwhile, we will compare the dnd genes in both bacteria and archaea to analyze the phylogeny of dnd systems.

近年来，我们发现了DNA骨架上的第一例生理修饰—DNA磷硫酰化修饰。该修饰由dndABCDE基因簇负责完成，能够用硫原子取代磷酸二酯键上的非桥联氧原子。DNA的磷硫酰化修饰在不同菌属间存在序列特异性，且具有Rp空间构象专一性。前期对DNA磷硫酰化修饰的研究工作一直集中于细菌。我们通过序列比对发现，在一些古菌中也存在dnd同源基因簇，暗示古菌 DNA中可能存在着磷硫酰化修饰。最近我们通过LC-MS/MS的方法验证了古菌DNA上确实存在DNA磷硫酰化修饰。作为“三域系统”中最古老的一类生命体，古菌中的DNA磷硫酰化修饰系统无疑引人关注。本项目拟鉴定古菌中磷硫酰化修饰的决定基因、修饰序列和修饰频率；揭示DNA磷硫酰化修饰位点在古菌基因组上的精确分布以及对全局基因表达、生命活动的影响；另外，通过与细菌中的DNA磷硫酰化修饰系统比较，分析其在不同域生物中的特异性分布，解析其起源、进化过程及分化动力。

近年来，我们发现了DNA骨架上的第一例生理修饰—DNA磷硫酰化修饰。然而前期对DNA磷硫酰化修饰的研究工作一直集中于细菌。我们发现，一些古菌中也存在dnd同源基因簇。作为“三域系统”中最古老的一类生命体，古菌中的DNA磷硫酰化修饰系统无疑引人关注。.依托本项目，主要完成了以下研究：.（1）鉴定了古菌中DNA磷硫酰化修饰的序列及修饰频率特征。完成对6株古菌的DNA磷硫酰化修饰类型和频率进行了定性和定量分析，揭示了古菌中独特的DNA磷硫酰化修饰特征。.（2）阐明了古菌DNA磷硫酰化修饰在基因组水平的精确定位。通过SMRT技术对4株古菌进行了全基因组测序，发现DNA磷硫酰化修饰发生4 bp在保守的核苷酸序列和明显的序列偏好性；没有集中分布在基因组上的特定区域，而是分散在基因组上。.（3）鉴定了古菌中与dndCDEA修饰基因簇偶联的pbeABCD限制基因簇。检测了pbeABCD限制基因簇转化菌株对SNJ1病毒的抵抗能力，结果表明pbeABCD-dndCDEA基因簇构成一套新型抗病毒系统。.（4）揭示了古菌中DndCDEA-PbeABCD系统的抗病毒分子机制。我们揭示了PbeABCD系统抗病毒功能依赖于古菌基因组上的DNA磷硫酰化修饰。其存在与否不会影响宿主对噬菌体的吸附，也不会切割或降解病毒DNA，而是通过抑制病毒DNA复制的方式阻断病毒传播。.（5）DNA磷硫酰化修饰在不同域生物中的特异性分布与进化迁移的启示。系统发育分析表明古菌的Dnd系统并没有聚成一簇，而是分散在整个进化树中，且与细菌的Dnd系统聚集成簇，揭示古菌与细菌的Dnd系统存在横向基因转移的可能性。部分古菌的Pbe系统同样具有明显的域内或域间横向基因转移的特征。. 至此圆满完成了本项目的研究内容和目标。该研究与以往发现的依赖蛋白-蛋白互作而发挥防御功能的机制完全不同，代表一种新型的依赖于DNA表观修饰的防御机制。项目负责人陈实教授以通讯作者以题为“古菌中一种新型依赖磷硫酰化的抗病毒系统”于2019年4月发表于Nature Communications等杂志上，申请了国家发明专利。还受邀以通讯作者在Angew Chem Int Ed、FEMS Microbiology Reviews、Biotechnology Advances、Medicinal Research Reviews等发表综述文章。