靶向PUMA蛋白小分子抑制剂作为急性辐射防护剂的研究

With widely application of nuclear energy, the induced radiation would cause radiation damage inevitably. At present, there is still no ideal high-efficiency and low-toxicity radioprotectant. Based on the fundamental origin of hematopoietic injury, our group focuses on the vitally important Bcl-2 apoptosis family, especially the structure-unique PUMA among pro-apoptosis proteins. On account of PUMA’s outstanding competitiveness against other pro-apoptosis member to bind all of five anti-apoptosis proteins, we would take the lead in systematical research work on small-molecular PUMA inhibitors. In previous research, a confirmed pharmacophore was established by dynamics simulation, key amino acid contribution analysis and decoy database validation, on which, several high-match compounds were screened out based on virtually primary screening, followed by binding energy and interface re-screening. We would do more research on the anti-apoptosis bioactivity of those selected compounds to obtain highly efficient and lowly toxic members, further on rationally structural derivatization. Finally we would draw a comprehensive conclusion of SAR (structure-activity relation) based on those derivatives’ bioactivities both in vivo and in vitro. By all of above studies, we would obtain several lead PUMA-inhibitors, which will be a pioneering contribution to the development of targeted radioprotectant.

核能、射线的应用日益广泛，其产生的电离辐射不可避免地会造成特定人群的辐射损伤，而急性骨髓型损伤是其中最普遍的类型。目前，尚缺乏理想的高效低毒防护剂，而靶向作用一直是药物降毒增效最有效的措施。课题组立足骨髓型损伤的根本源头，针对细胞凋亡中至关重要的Bcl-2凋亡家族，着眼于此家族中结构特殊的促凋亡蛋白PUMA，根据其能竞争优先地结合所有抗凋亡蛋白而导致细胞凋亡的特性，拟系统研究PUMA小分子靶向抑制剂这一国内空白领域。前期已通过动力学模拟、氨基酸分析、诱饵数据库验证，获得了明确的药效团模型，并经过模拟初筛、结合能和接合界面复筛，获得匹配度最高的化合物，拟进一步深入进行抗凋亡活性和毒性测试，遴选高效低毒的活性化合物，并对它们的结构合理化衍生，通过体内外毒性和活性研究，建立化合物结构与防护活性之间的构效关系，从而获得PUMA抑制剂先导结构。该开创性工作将为发展靶向低毒高效的辐射防护剂提供依据。

骨髓型辐射损伤是机体遭受辐射后，干细胞等发生凋亡而直接引起的。所以，立足细胞凋亡机理是辐射损伤防护研究的根本策略。PUMA作为一种竞争有力、功能强大、结构清晰的促凋亡蛋白，是辐射防护剂设计的理想靶标。抑制PUMA与抗凋亡蛋白的结合，是辐射防护研究的前沿领域。.我们课题组针对PUMA的晶体结构，通过分子动力学模拟，建立了PUMA与抗凋亡蛋白结合腔，分析了PUMA上关键氨基酸的能量贡献，发现了提供关键能量的重要氨基酸，它在蛋白结合中至关重要。根据结合腔的空间、能量特性，我们构建并筛选了药效团模型，通过诱饵数据库验证了模型有效性，进而使用该明确的药效团模型。基于此药效团模型，我们进行了化合物库的筛选，获得匹配度最高的化合物结构，并从蛋白和细胞水平对筛选得到的化合物进行活性测试。获得如下结果：.1. 构建了Mcl-1-PUMA复合物的结构模型，并通过动力学模拟对其稳定性进行分析， 通过已有PUMA抑制剂结构特征，建立了基于配体的药效团模型；再基于配体和受体进行优化，该模型具有了高灵敏性和高选择性；2.构建了Mcl-1-和化合物的复合物模型，并通过动力学分析、能量分解、FPA实验验证重要的氨基酸位点。3. 成功构建了过表达PUMA以及PUMA-△BH3的腺病毒,并用以上的腺病毒感染细胞遴选先导结构；4. 通过系统的有机合成，成功获得了多种结构类型的衍生物。5. 对以上获得衍生物进行了综合的活性测试，获得了高活性化合物，它们对PUMA介导的细胞凋亡具有明显的抑制作用，当PUMA的BH3区域突变时，它们抑制细胞凋亡的活性消失，表明化合物特异性直接作用于PUMA的BH3区域。6. 对这些化合物的体内外的辐射防护进行了测试，获得了防护作用强的小分子抑制剂。.所以，本课题针对明确的PUMA蛋白靶标，进行抑制剂的筛选、衍生、活性评价、构效研究是辐射防护剂的靶向药物研究前沿，可填补国内PUMA小分子抑制剂研究的空白。本课题将为此类药物先导的发现和进一步理性设计提供重要的依据，为骨髓型放射损伤的高效低毒防护剂研究夯实理论基础。