78kD葡萄糖结合蛋白(GRP78)在核糖糖化中的作用及细胞死亡机制

Glycation not only resultes in dysfunction of a protein but also produces cytotoxic advanced glycation end products, which lead to cellular metabolic problems and even cell death. Increase in glycated protein is commonly observed in metabolic disorders especially in diabetes. The increase in concentrations of glycated protein is closely related with the complications of diabetes. However, for several decades, D-glucsoe and the related pathways have been paid great attentions to the glycations and diabetic complications. Very few groups have investigated the relationship between D-ribose and glycation, and the resultant advanced glycation end products. In fact, D-ribose is very active in glycation because of its special chemical characteristics. As shown by our previous work, ribosylation is much more active than glycosylation, rapidly reacting with protein and formation of cytotoxic products. Here, the applicants attempt to establish the D-ribose-glycated cell models as well as D-ribosed-glycated cognitive impairment animal models (mouse and rat), in order to study ribosylated 78 kD glucose regulated protein (GRP78), Tau, alpha-synuclein and changes in functions and the resultant cytotoxic products. Occurence and development of ribosylation in vivo and the related pathological pathways would clarify the mechanism of ribosylated protein leading to animal cognitive impairments.

蛋白质的非酶糖基化（简称蛋白糖化）不但使蛋白质丧失生物学功能，同时可以产生具有细胞毒性的糖基化蛋白终末产物，导致细胞功能紊乱，乃至死亡。非酶糖基化蛋白的升高，常见于糖尿病等代谢性疾病，并与糖尿病的并发症的发生发展密切相关。然而，在过去的几十年里，大量的报道集中在葡萄糖代谢及其相关途径方面，但对于核糖导致的蛋白质非酶糖基化的研究非常少。由于核糖的特殊结构，使其具有很强的蛋白非酶糖基化性质。申请者的实验室前期工作表明：核糖糖基化性质远比葡萄糖活泼，能够迅速与蛋白质发生反应，形成具有明显细胞毒性的产物。本项目拟建立核糖非酶糖基化的细胞模型、核糖导致的认知功能障碍动物模型（鼠模型），研究78 kD葡萄糖调节蛋白（GRP78）、Tau、突触核蛋白等的核糖非酶糖基化及其功能变化，糖化后的细胞毒性；核糖非酶糖基化在细胞内的发生以及相关代谢途径，阐明核糖非酶糖基化导致动物的认知功能障碍的分子机制。

摘要.自从1815 年法国化学家Chevreul 发现糖尿病患者尿液中含葡萄糖以来，历时200余年，糖尿病一直被认为是一种以慢性血葡萄糖水平增高为特征的代谢病群。然而，广泛存在体内的核糖(D-ribose)，在糖尿病及其并发症的研究中却被忽略。因此，研究核糖糖基化对蛋白和细胞的作用，有助于从一个崭新的角度探索糖尿病及其并发症，特别是糖尿病脑病的机制，具有一定的理论和临床参考价值。.项目执行者围绕“78kD 葡萄糖结合蛋白(GRP78)在核糖糖化中的作用及影响细胞死亡机制”这一关键科学问题开展了研究工作。首先，作者对Castells还原糖测定方法进行改良，解决了在基础研究和临床上测定核糖的技术问题。对 2型糖尿病临床患者和同龄正常人的尿核糖及葡萄糖进行了分析。结果表明，糖尿病患者尿中的核糖浓度显著高于正常对照，提示糖尿病不但存在葡萄糖代谢失调，而且存在核糖代谢失调。在此基础上，作者以CHO细胞系进行了核糖糖基化的研究，观察到在核糖的存在下，AGEs在细胞内形成和蓄积，同时导致细胞活力的下降。采用免疫沉淀技术，从核糖孵育的CHO细胞抽提物中分离出分子量约为70kD的蛋白质，质谱分析结果表明，该蛋白为GRP78。核糖导致细胞内蛋白质糖基化的速度远比葡萄糖快。核糖引起细胞释放乳酸脱氢酶（LDH）的一级动力学常数超过葡萄糖的7倍多，表现出较强的细胞毒性。糖基化GRP78定位于内质网，且其免疫荧光信号部分与AGEs重合。Western blotting显示，在与核糖孵育的条件下，GRP78的表达有先升高再降低的过程。采用siRNA降低GRP78的表达，或通过抑制剂epigallocatechin gallate (EGCG)降低GRP78的功能，均导致细胞内AGEs的显著增加，细胞活性明显下降。说明GRP78具有抑制AGEs在细胞内的形成，保护细胞的活力。相反，超表达GRP78，可以显著减少AGEs的形成和细胞的死亡。这些结果表明，GRP78不但可以降低核糖糖基化产物的形成，同时可以在核糖孵育的条件下保护细胞活力。通过长期喂食核糖，建立了C57BL/6J小鼠认知损害模型，其脑内出现A沉积，Tau蛋白异常磷酸化，胶质细胞激活等病理表现。在相同条件下，葡萄糖喂食的小鼠的相同病理表现却不明显。该模型的建立，为进一步研究GRP78和核糖代谢失调导致的认知损害机制奠定了基础。