一种新的活细胞内标记蛋白质错误折叠的荧光探剂

蛋白质错折叠的研究不但是生命科学中的一个重要基础课题，也是神经退行性疾病发病机制研究领域中的重大科学问题。蛋白质如何错误折叠，特别是错误折叠蛋白质如何与细胞相互作用进入细胞，在胞内分布与作用；错误折叠产物如何导致神经细胞的代谢障碍及其死亡等，都是相关领域亟待阐明的问题。到目前为止，尽管已经有了标记蛋白质错误折叠荧光标记物，如Thioflavin T、Thioflavin S以及ANS等，但尚未寻找到一种能够在活细胞内特异标记错误折叠蛋白质的荧光探剂。本项目旨在研究一种能够在活细胞内特异标记错误折叠蛋白质的荧光标记物（荧光探剂），将有可能研究错误折叠蛋白质在神经细胞内分布以及由此而导致的细胞功能障碍的分子机制，同时也可以进行活细胞内错误折叠蛋白质的动力学研究。这种新荧光探剂方法的研究与建立，将对蛋白质错误折叠在细胞内代谢研究领域起到推进作用。

蛋白质翻译后修饰的异常及蛋白质错误折叠与许多疾病的发生发展相关，如神经退行性疾病、糖尿病、动脉粥样硬化等。尽管国际上已经建立了一些小分子标记错误折叠蛋白质的方法，如Thioflavin T（ThT）、Congo red及1-anilinonaphthalene-8-sulfonic acid （1,8-ANS）等，但它们不能直接用于活细胞标记。因此，需要研究出一种能够在活细胞内标记错误折叠聚积蛋白质的荧光探剂，能够直接观察错误折叠蛋白质在活细胞内的动态变化过程。本项目采用丙二醛修饰突触核蛋白，制备具有荧光发色特性的蛋白聚集物。采用malondialdehyde-modified alpha-synuclein （MDA-Syn）聚集物与BV-2细胞共孵育，在不同时间采用激光共聚焦显微镜观察MDA-Syn的荧光（460 nm）在细胞内外的分布，实现了对MDA-Syn蛋白聚集物进入细胞以及在细胞内的动态过程的监测。在观察MDA-Syn聚集物的同时，采用anti-actin, anti-LAMP1或propidium iodide分别对细胞内的actin骨架蛋白、溶酶体以及细胞核进行标记；从而实现对MDA-Syn聚集物与actin或溶酶体相互作用的观察与定位。在观察MDA-Syn聚集物的同时，采用LysoTracker标记活细胞内的溶酶体；从而实现在活细胞状态下对MDA-Syn聚集物与溶酶体相互作用的观察。采用该荧光探针，项目承担者初步证明了，MDA-Syn聚集物可以通过胞饮的方式进入BV-2细胞，与溶酶体融合分布在细胞质内。MDA-Syn聚集物荧光标记物的研究与应用，不但为蛋白质修饰与错误折叠研究领域提供了新的技术，同时为进一步探索蛋白质异常修饰、错误折叠及相关疾病的分子机制提供新的细胞学方法。