聚ADP-核糖化途径在苯所致DNA损伤修复中的作用

Benzene is ubiquitous in environments. The toxicity of low level benzene is an increasing concern. Research has shown benzene can induce DNA damage and oxidative stress, change DNA methylation status. Poly(ADP-ribosylation) of protein is involved in DNA damage repair, cell death, DNA methylation. Our research showed PARP-1 participated the hydroquinone induced DNA damage and DNA methylation. We supposed poly(ADP-ribosylation) of protein have a fundamental role in the benzene genotoxicity. The individual's different poly(ADP-ribosylation) pathway will make a great difference to the outcome. In this research, we'll compare subject under different benzene exposure in terms of PARP-1, PARG expression, and DNA methylation, mitochondrial DNA copy number and so on. And quatify the benzene environmental dose and biological dose, combine cell research with RNAi, DNA methylation pyrosequencing. We seek to elucidate the role of poly(ADP-ribosylation) in DNA damage repair induced by benzene exposure, to find the potential dose-effect( reaction) relationship of benzene exposure, to explore a sensitive and specific biomarker, to find a potent health surveillance method for the people exposed to benzene.

苯广泛存在于外界环境中。低浓度苯的毒性日益受到关注。研究表明苯会致DNA损害，DNA甲基化改变，氧化应激。氧化应激会引起线粒体改变。聚ADP-核糖途径广泛参与细胞DNA修复，DNA甲基化，同时也需要消耗能量，我们发现PARP-1参与了氢醌所致DNA损害及DNA甲基化过程,由此推测聚ADP-核糖途径在苯的遗传毒性中处于枢纽地位，个体不同的聚ADP-核糖化途径，对苯暴露的健康效应具有重要作用。本研究将对比不同人群的PARP-1,PAPG表达，DNA甲基化，及线粒体功能状态。定量评价暴露人群苯内外剂量，结合细胞研究，利用RNAi，DNA甲基化测序等手段，在苯暴露中对聚ADP-核糖化途径进行系统研究，探讨聚ADP-核糖化途径在苯致DNA损伤修复中的作用，探索苯暴露引起的剂量效应（反应）关系，寻找敏感特异的分子标志物，为苯接触人群更为有效的健康监护提供思路。

苯是使用广泛的工业及环境污染物，长期低浓度苯暴露日益受到关注。聚ADP-核糖化途径参与许多生命活动如细胞凋亡、DNA 修复、基因转录和维持基因组完整性等。细胞合成聚ADP核糖复合物主要由聚腺苷二磷酸核糖聚合酶1 [poly（ADP-ribose）polymerase 1，PARP l]催化。为更加深入了解聚ADP-核糖化途径在苯所致DNA损伤中的作用，本研究利用RNA干扰技术抑制TK6细胞中聚ADP-核糖化作用的两个蛋白质：PARP-1及聚ADP-核糖水解酶（PARG），经RT-PCR及western blot检测发现抑制效果显著，达到80%以上（P＜0.01），分别命名为TKP和TKG细胞。缺陷细胞生长、形态未见明显变化。利用浓度为0,5,10,20,40,80,160,320umol/L的氢醌处理TK6细胞，染毒时间分别为6h,12h,24h及48h，根据细胞增殖曲线，确定以0，5，10及20uM的HQ处理细胞48h进行后续细胞毒理研究。对各浓度氢醌处理下三种细胞进行凋亡检测，显示抑制细胞PARP1表达本身并不会引起细胞凋亡，在HQ不同浓度作用下，TKP，TKG细胞与正常TK6细胞均表现出剂量依赖性的凋亡增加，不同的是PARP1被抑制的TKP细胞在20uM氢醌作用下细胞凋亡率为42.73%，相比TK6（22.77%）及TKG细胞（24.1%）凋亡显著增加（P＜0.05）。TK6细胞与TKG细凋亡未见显著差异。为了探索引起凋亡原因，对不同浓度HQ处理48h后的细胞进行活性氧检测，TK6，TKP及TKG三种细胞中活性氧均显著增加，在同浓度氢醌处理条件下，TKP细胞中活性氧含量高于TK6及TKG细胞。利用质谱检测对氢醌处理后TK6细胞进行差异蛋白组研究，鉴定出差异表达的20个蛋白质信息，其中8个蛋白与细胞氧化损伤密切相关，5个属于线粒体蛋白,并且利用western blot 进行了验证。在职业性苯接触人群的研究中发现，低浓度苯暴露引起PARP1，DNA甲基转移酶（DNAMethyltransferases，DNMTs)，甲基化CpG结合蛋白2（methyl-CpG-binding domain protein 2，MBD2)的表达下降，可能与低浓度苯暴露人群的整体低甲基化有关。细胞研究也发现氢醌处理后引起细胞DNA整体低甲基化，DNMT1启动子区域高甲基化。