HBeAgase与乙型肝炎核心抗原HBeAg的作用机制及其对肝细胞的保护

Hepatitis B is seriously harmful to the healthy of Chinese People, which is one of the most important problems for the public health. Recently, the applicants found that the HBeAg could be converted from positive to negative for the patients with cerebral infaction after taking "capsule of earthworm lumbrokinase" a group of earthworm proteases. This result is significant for us to carry out this project in which we have isolated an isozyme from the earthworm of Eisenia faetida. We called the isozyme HBeAgase because it can degrade HBeAg rapidly both in vivo and in vitro. Here, the applicants attempt to study the structure and function of HBeAgase and the effect on the molecule of HBeAg and identify the cleavage sits on HBeAg. Using HepG2.2.15 cell line, tansgenic mice and sheldrake, to explore the relationship between the degradation of HBeAg and liver protection, as well as the mechanism of this isozyme in the absorption through intestines and the distribution in liver. Our project will shed light on the further understanding the role of HBeAg in hepatitis and provide some important information to investigate new drug to regconize HBeAg as a potential target in the treatment of patient with hepatitis.

乙型肝炎严重危害我国人口健康，是我国最为重要的公共卫生问题之一。申请者发现，在口服"蚓激酶"胶囊（蚯蚓蛋白酶同功酶复合制剂）治疗脑血栓病人的过程中，其中具有肝炎核心e抗原阳性的病人，出现HBeAg转阴性或降低的现象。这一现象的发现，促使申请者从赤子爱胜蚓（Eisenia fetida）中分离出了一种同功酶，该酶能够识别和降解乙型肝炎核心e抗原，因此，申请者将其并命名为乙型肝炎核心e抗原酶HBeAgase。在此，本项目拟研究蚯蚓蛋白同功酶的结构与功能，包括与乙型肝炎核心e抗原的作用，HBeAgase在HBeAg上的作用位点。通过HepG2.2.15细胞系，同转基因小鼠、龙岩麻鸭等模式动物的研究，阐明HBeAg的降解与保护肝细胞之间的关系，包括HBeAgase在肠道吸收机制及在肝脏中的分布。从而进一步理解HBeAg在乙型肝炎中的作用，为研制以HBeAg作为潜在靶点的新药提供理论基础。

乙型肝炎病毒e抗原（HBeAg）在血清中显阳性，往往表示乙型肝炎病毒（HBV）在肝内复制活跃，在血液中存在HBV DNA和病毒粒子。HBeAg的线性表位是T淋巴细胞的结合部位，具有免疫调节作用。HBeAg可诱导生成一类免疫能力低下的树突状细胞（DCs），这可能是慢性HBV持续感染的原因之一。近二十年来，采用6种蚓激酶同功酶混合物（LKI）为有效成分，制备的“蚓激酶胶囊”在治疗脑中风等血栓性疾病，具有良好的效果和安全性。本项目将HBeAg作为潜在靶分子，采用蚓激酶同工酶发挥作用，以阻扰HBeAg与T淋巴细胞的结合，降低HBV持续感染。作者采用亲和层析等方法，对LKI进行了分离，纯化出一种蚓激酶同工酶（HBeAgase），能够高效降解HBeAg。采用变性剂盐酸胍研究酶的稳定性显示，HBeAgase具有较高的复性能力。HBeAgase可以降低HepG2.2.15细胞分泌的HBeAg，在HBeAg上的切割点（R92/D93）位于结合T细胞的线性表位，降解HBeAg，产生一条约9.6kDa的片段。进一步实验表明，包括HBeAgase在内的6种蚓激酶同工酶LKI，降解HBeAg产生一条约13kDa肽段，继而完全降解HBeAg。也就是说，LKI具有与HBeAgase相同的功能。.采用LKI灌胃，能够降低Balb/c-HBV转基因小鼠血清HBeAg和HBsAg水平，以及肝组织HBcAg的含量；同时降低血清谷丙转氨酶和谷草转氨酶的水平，显示出保护肝脏功能的作用。LKI可以切断纤维连接蛋白（FN）的HBsAg结合区SBR（R2058/R2059），降低C57BL/6J-HBV（subtype ayw）转基因小鼠血清和肝组织FN的含量，从而可能影响HBV与FN的结合。LKI灌胃，能够降低乙型肝炎自然感染动物模型——龙岩麻鸭血清中的DHBV DNA水平。这些结果表明，LKI可以干预HBV的复制和传染。LKI的吸收机制研究显示，LKI可以泡饮的方式进入Caco-2细胞，也能够被吸收进入十二指肠壁。对大鼠腹腔注射LKI，并在血清和肝组织中测定LKI的活力，结果显示，LKI不但可以进入血液，而且能够进入肝脏。结论：LKI可以有效降低动物体内HBeAg、HBcAg、HBsAg，以及血清HBV DNA，也能够起到保护肝脏的作用。LKI有望成为干预慢性乙型肝炎及肝组织纤维化的潜在药物。