树突状细胞在减毒李斯特菌肝癌疫苗Lmdd-MPFG抗肿瘤作用中的免疫调控机制研究

Attenuated Listeria Monocytogenes (LM) vaccine has been investigated in many phase I clinical trials against various tumors for its high efficacy to elicit anti-tumor immunity in the body. In our previous study, we have developed a LM vaccine against hepatocellular carcinoma, Lmdd-MPFG, which is a highly attenuated LM vaccine with dal and dat regions deletion. The antigen MPFG will form a multi-CTL-epitopes virus like particle including HBcAg、HBx Ag、AFP、MAGE-3 epitopes. Our previous results showed Lmdd-MPFG can not only induce hepatocellular cancer specific CTLs, but also break the negative immune regulation in tumor microenvironment. However, the mechanism how the vaccine works still remains unclear. In this study, we will further elucidate, based on our previous study, the relationship between Lmdd-MPFG and dendritic cell differentiation and maturation in vitro and in vivo. The potential relationship will be proved by antibody blocking, key genes knockout models and siRNA interference. The roles of NOD like receptors will be focused in the network of Lmdd-MPFG and DC. The effects of DC on the T cell subtypes and functionality will be addressed as well. The whole study will unravel the complexity regulatory role of DC in the Lmdd-MPFG induced anti-tumor immunity and provide principles for clinical trials to treat liver cancers.

减毒李斯特菌LM疫苗能激发机体产生有效的抗肿瘤免疫，目前已应用于多种肿瘤的临床I期试验。我们已制备了dal和dat基因缺失的高度减毒李斯特菌肝癌疫苗Lmdd-MPFG，其靶基因MPFG是以HBcAg、HBxAg、AFP、MAGE-3为靶点构建的病毒类似颗粒（VLP）多价CTL表位基因。前期研究已证实该疫苗在诱导肿瘤特异性CTL时，亦能打破肿瘤微环境的免疫抑制状态，但是确切机制尚不清楚。本研究拟在前期工作基础上，在细胞水平和动物模型上明确肝癌减毒Lmdd-MPFG疫苗与促DC分化成熟的关系，再通过抗体封闭、基因敲除或siRNA干扰等技术对Lmdd-MPFG对DC的影响进行深层次的机制分析研究，确定调控DC活化的关键NLR分子和多维动态调控网络，进而研究DC内NLR的功能状态对T细胞亚群等炎症细胞的影响，以探讨DC在Lmdd-MPFG疫苗抗肿瘤作用中的调控机制，为开展肝癌临床免疫治疗提供依据。

减毒李斯特菌LM 疫苗能激发机体产生有效的抗肿瘤免疫，目前已应用于多种肿瘤的临床I 期试验。我们已制备了dal 和dat 基因缺失的高度减毒李斯特菌肝癌疫苗Lmdd-MPFG，其靶基因MPFG 是以HBcAg、HBxAg、AFP、MAGE-3 为靶点构建的病毒类似颗粒（VLP） 多价CTL 表位基因。本课题组证实该疫苗在诱导肿瘤特异性CTL 时，亦能打破肿瘤微环境的免疫抑制状态。进一步探明机理发现，LM可明显促进DC活化，NOD1/NOD2，NLRP3以及TLR4在LM诱导DC活化过程中发挥重要作用，这些分子主要通过NF-kB以及Caspase-1相关信号通路发挥调控功能。LM感染时刺激和干扰相关受体后可引起DC相应的表型功能变化，NOD1/NOD2，TLR4和NLRP3在LM感染的DC细胞内发挥交叉递呈作用。体内实验和临床标本证实DC可以通过增强LM引起的特异性CTL反应，改变T细胞分群，特别是IL-17A分泌T细胞的增多来发挥抑瘤效应。为进一步研究以Lmdd为基础的疫苗的安全性和有效的抗肿瘤效应，我们还构建的肝癌减毒疫苗Lmdd-CD24。该疫苗进入机体后主要分布于脾脏，其次为肝脏和肺脏，且高度减毒，在小鼠体内仅能存活约3 天的时间，仅引起机体（脾脏、肝脏等）产生轻微的炎症反应。LD50 约为0.5-1× 108，而野生型菌株为1 × 104。Lmdd-CD24 疫苗免疫转基因荷瘤鼠后能改变Th1/ Th2 失衡状态，转而以诱导Th1 型应答为主，且CD8+ T 细胞在体内抗肿瘤作用中发挥主要的作用，同时该疫苗未能诱导出明显的Th2/抗体介导的体液免疫应答。肿瘤恶化也涉及肿瘤干细胞相关的膜蛋白CD24表达的增高，CD24已被证实与实验模型中肿瘤的形成和转移密切相关。同时发现LM感染后DC表达pmTOR、pp70S6K和p4EBP1水平降低，并促进Beclin 1的磷酸化和LC3II的聚集，提示LM可诱导DC的自噬。以上结果为开展肝癌临床免疫治疗提供依据。发表SCI论文8篇，参加学术交流3次，培养研究生4人，获教育部自然科学奖一等奖及江苏省高校自然科学二等奖。