EB病毒LMP2特异性T细胞受体在过继性治疗鼻咽癌中的研究

EBV-LMP2特异性CTL在抗鼻咽癌免疫中起关键作用，然而患者体内CTL数目及反应性明显低下，往往不能产生有效的抗肿瘤应答。本研究将PL5.04、PL5.05、QIMR-NB20 及QIMR- CSIC7 四种针对EBV-LMP2的TCR基因亚克隆到逆转录病毒载体，以产生高效、安全的逆转录病毒颗粒，感染人外周血T细胞后检测TCR表达水平，研究四种不同TCR基因转染T细胞后体外激发特异性细胞免疫反应情况，以筛选出有效的TCR；用活化T细胞核因子（NFAT）报告基因检测转染的TCR的功能；同时构建TCR-CD3ζ融合基因，以提高免疫应答效能，从而确定一个对治疗鼻咽癌最合理的TCR基因疫苗；进而建立鼻咽癌荷瘤裸鼠模型并检测TCR基因激发的CTL回输荷瘤鼠的体内抑瘤效应。该课题将阐明针对EBV-LMP2的TCR诱导产生特异性保护应答的免疫机制，为EBV相关肿瘤的过继性治疗提供理论基础与科学方法。

EBV-LMP2特异性CTL在抗鼻咽癌免疫中起关键作用，然而患者体内CTL数目及反应性明显低下，往往不能产生有效的抗肿瘤应答。本研究将PL5.04、PL5.05、QIMR-NB20 及QIMR- CSIC7 四种针对EBV-LMP2的TCR α链和β链基因定向克隆于慢病毒载体，与辅助病毒载体共转染293T细胞，以产生高效、安全的逆转录病毒颗粒，感染人外周血T细胞后检测TCR表达水平，TCR PL5.05的表达效率最高。之后研究四种不同T细胞特异性启动子Vβ6.7, delta, luria和 Vβ5.1启动TCR基因转染T细胞后体外激发特异性细胞免疫反应情况，包装出的慢病毒能高效的表达于CD3+ T和HSB 2细胞，其中Vβ6.7启动 的表达效率最高，且启动效率不随时间的延长而衰减。通过比较激发特异性细胞免疫反应的强弱，确定杀伤效果最强为Vβ6.7启动的TCR转染的 T细胞，能有效的杀伤表达LMP2的靶细胞并表达高水平的INF-γ。同时构建TCR-CD3ζ融合基因，将CD3ζ基因导入至PL5.05 TCR中，可加强TCR活化信号的转导，达到强化治疗性T细胞功能的目的，以确定一个对治疗鼻咽癌最合理的TCR基因疫苗。建立鼻咽癌荷瘤裸鼠模型，将TCR基因转染T细胞激发的CTL回输荷瘤鼠能观察检测到体内抑瘤效应。并以此为基础，进一步研究EB病毒LMP2A通过MTA1诱导鼻咽癌发生上皮-间质转化（EMT）中的作用机制，研究结果表明，通过对40例鼻咽癌患者的MTA1免疫组化染色分析，初步证实MTA1与鼻咽癌的转移侵袭呈正相关性，肿瘤组较正常组MTA1和Vimentin的表达水平升高，E-cadherin表达下降，并通过体外构建MTA1过表达以及siRNA干扰鼻咽癌细胞系证实MTA1的表达可以促进鼻咽癌的转移侵袭。为验证LMP2是否调控MTA1，我们构建了LMP2A过表达以及表达LMP2A而siRNA干扰MTA1的细胞系，研究表明LMP2A引起的鼻咽癌EMT可以通过活化MTA1介导LMP2A的表达可以增加MTA1的表达；对表达LMP2A的细胞干扰其MTA1的表达后，其EMT程度有一定程度的降低。该课题阐明了针对EBV-LMP2的TCR诱导产生特异性保护应答的免疫机制，为EBV相关肿瘤的过继性治疗提供理论基础与科学方法。