李斯特菌载体在增强丙型肝炎病毒重组多表位树突细胞疫苗中的作用

HCV引起慢性肝病严重危害人类健康。目前缺乏理想治疗药物,尚无有效疫苗问世。治疗性DC疫苗是最有前途攻克HCV持续感染的新技术,导入外源基因进入DC的方法是决定疫苗免疫应答的关键环节。近年研究发现，LM对DC和单核/吞噬细胞有独特的亲嗜性,并具有免疫佐剂效应，受到学者的重视。基于我们前期HCV重组多表位DC疫苗的研究基础,借鉴LM载体对DC的感染的独特优越性,提出本课题的研究思路:选择前期证明的HCV6个CTL表位和2个Th表位,构建重组HCV多表位的LM载体(LM-HCV)；分别感染人和小鼠DC细胞,制备人源和鼠源LM-HCV-DC疫苗；选取健康志愿者PBMC和C57BL/6小鼠,分别比较我们前期应用的重组HCV腺病毒DC疫苗(ad-HCV-DC)和LM-HCV-DC疫苗诱导的T细胞免疫应答效果;探索其增强DC疫苗的作用机制,为LM载体在临床应应用提供实验依据。

HCV引起慢性肝病严重危害人类健康。目前缺乏理想治疗药物,尚无有效疫苗问世。治疗性DC疫苗是最有前途攻克HCV持续感染的新技术,导入外源基因进入DC的方法是决定疫苗免疫应答的关键环节。近年研究发现，LM对DC和单核/吞噬细胞有独特的亲嗜性,并具有免疫佐剂效应，受到学者的重视。. 本课题应用同源重组技术成功构建了毒力因子actA和inlB双缺失的李斯特菌突变株，为重组疫苗治疗感染性疾病提供了一个平台。动物实验表明所构建的actA和inlB双缺失李斯特菌突变株毒力显著下降。雄性BALB/c小鼠动物毒力试验中，重组菌株所测得的LD50为1.47×108CFU，野生型细菌所测得的LD50为 6.81×104CFU，数据表明重组菌毒力降低了4个数量级。雌性BALB/c小鼠动物毒力试验中，重组菌株所测得的 LD50为3.16×107CFU，野生型细菌所测得的LD50为6.81×105CFU，数据表明重组毒力降低了2个数量级。通过双基因缺失毒力因子actA和inlB获得毒力显著降低的减毒菌，表明actA和inlB是产单核细胞李斯特菌的重要毒力因子。成功构建重组HCV多表位基因减毒菌（LM-E1、LM- NS4B&P7 、LM-NS4B&P7&E1），为疫苗研究奠定基础。. 细胞实验结果表明：表达HCV多表位基因减毒李斯特菌可促进DC细胞成熟。LM-HCV刺激imDC细胞后，流式细胞术检测DC细胞表面标记物表达显著升高。ELISA检测LM-HCV与DC细胞共培养上清发现：表达HCV多表位基因减毒李斯特菌可促进DC分泌IL-12，从而增强DC细胞功能。CCK-8实验结果表明：表达HCV多表位基因减毒李斯特菌可增强淋巴细胞活性。.