基于自噬途径的减毒李斯特菌抗肿瘤作用机制研究

Attenuated Listeria monocytogenes(L. monocytogenes，LM) is a novel and promising cancer vaccine vector. The nonspecific antitumor effect of LM has been confirmed, but the mechanism remains unclear. Previous studies demonstrated that attenuated LM promoted autophagy and cell death in LL/2c tumor cells, and tumor cell death induced by attenuated LM were accelerated by blockade of autophagy. Thus, this study attempts to examine the role and molecular mechanism of autophagy in the antitumor efficacy induced by attenuated LM. Firstly, the changes of autophagy will be confirmed in B16F10 melanoma cells and LL/2c tumor cells infected with attenuanted LM by immunofluorescence technique and Western blot. Furthermore, tumor cell lines stably overexpressing and silenced autophagy associated gene were constructed, and the exact role of autophagy in tumor cells death induced by attenuated LM will be determined in tumor cell lines and in tumor-bearing mice. The molecular mechanisms of autophagy in tumor cells elicited by attenuated LM will be further elucidated. Taken together, these findings will provide new evidences to antitumor mechanism of attenuated L. monocytogenes and novel insights for targeted biological therapy of cancer.

减毒单增李斯特菌（Listeria monocytogenes，LM）是目前用于肿瘤治疗中最为新颖且具有广泛应用前景的肿瘤疫苗载体之一。LM的非特异性抗肿瘤作用虽被证实，但机制尚不清楚。 我们前期研究发现减毒LM能够诱导LL/2c小鼠Lewis肺癌细胞死亡和自噬的发生，且初步证实抑制自噬可加快LM诱导LL/2c细胞的死亡，表明自噬和减毒LM抗肿瘤之间具有重要的联系。鉴于此，本项目拟以减毒LM感染LL/2c细胞、小鼠黑色素瘤细胞B16F10及小鼠肿瘤模型为研究对象，在明确减毒LM引起肿瘤细胞自噬发生的变化规律的基础上，利用超表达及RNAi的方法构建稳定超表达和沉默自噬基因的LL/2c和B16F10肿瘤细胞系，从体内外阐明自噬对减毒LM诱导肿瘤细胞死亡及凋亡的影响，并进一步解析减毒LM引起肿瘤细胞自噬的关键分子机制。本项目的开展，能揭示减毒LM抗肿瘤作用的新机制，并为肿瘤的生物治疗提供新思路。

单增李斯特菌（Listeria monocytogenes，LM）作为新颖的肿瘤疫苗载体之一，在肿瘤治疗中具有较好的应用前景。虽已证实LM具有非特异性抗肿瘤作用，但其机制仍不十分清楚。自噬是一种重要的细胞保护机制，是机体抵御病原入侵的第二道防线，研究发现自噬在肿瘤发生发展中具有重要作用。基于此，本研究以LM感染B16F10小鼠黑色素瘤细胞、小鼠Lewis肺癌细胞LL/2c及小鼠肿瘤模型为研究对象，分析LM诱导肿瘤细胞自噬形成的时效关系；利用自噬抑制剂氯喹（CQ）及RNAi技术，从体内外探讨自噬对LM诱导肿瘤细胞死亡的影响；并通过自噬上游信号通路蛋白的变化情况揭示LM诱导肿瘤细胞自噬的分子机制。围绕此，目前已取得如下以下研究进展和结果：1.证实了LM能够诱导B16F10/LL/2c细胞发生自噬，且在感染4-6h内自噬发生随着时间延长而增强；2.利用RNAi技术成功构建了沉默Beclin-1基因的稳转细胞系B16F10-m-Beclin-1-shRNA，该细胞系能够有效抑制B16F10细胞自噬过程；3.利用CQ以及Beclin-1 siRNA阻断自噬途径，显著增强了LM诱导B16F10细胞死亡能力，促进了B16F10细胞凋亡，并提高了LM在B16F10细胞内增殖水平；进一步也证实了LM联合CQ能够加速LL/2c细胞死亡。表明自噬活性的阻断显著增强了LM诱导B16F10/LL/2c细胞死亡能力；4.与LM单独免疫组相比，利用CQ以及Beclin-1 siRNA阻断自噬途径，联合LM免疫小鼠黑色素瘤及肺癌模型的荷瘤小鼠，能够显著地抑制小鼠肿瘤的生长，延长小鼠的存活时间；其中机制与抑制自噬增强了LM在肿瘤组织细胞内增殖能力及增加肿瘤细胞凋亡有关；5.通过体内外实验结果揭示了LM感染诱导小鼠黑色素瘤细胞及组织发生自噬是通过调节PI3K/AKT信号通路实现的，而与ERK信号通路无明显关系。以上研究表明抑制自噬可增强LM的抗肿瘤作用，这不仅丰富了LM抗肿瘤作用机制，而且为LM肿瘤疫苗载体的应用奠定基础。