HIV RT连接区新型耐药突变对病毒复制适应性的影响及其作用机制

耐药HIV流行株将对公众健康形成持续威胁，而复制适应性是衡量耐药毒株传播能力的最重要指标。本项目旨在研究RT连接区新型耐药位点T369V、A371V和TAMs联合出现时对病毒RT功能和复制适应性的影响。主要研究步骤如下：（1）利用反向遗传学技术，评价携带T369V+TAMs、A371V+TAMs、T369V+A371V+TAMs的病毒对NRTI和NNRTI药物的敏感性；（2）分别表达出野生型RT和携带上述突变的RT，对RT的RNase功能和cDNA合成能力进行测试,深入研究突变对RT功能的影响；（3）采用特殊的逆转录病毒载体pAT1和pAT2，获得含有上述突变的重组病毒，以野毒株为参照，采用多周期竞争生长实验评价病毒的相对复制适应性。通过对研究数据的综合分析，阐明新型耐药位点与TAMs的不同组合对RT功能和病毒复制适应性的影响，为我国针对耐药毒株的防治提供重要的理论依据和数据支持。

本课题研究内容主要分为以下四个部分：.一、对RT连接区的新型耐药突变对病毒复制适应性的影响进行了评价.采用Rockveller university大学建立的质粒pAT1/pAT2-PM1病毒竞争性复制适应性检测系统，对HIV-1 RT连接区的新型耐药突变联合TAMS突变对病毒复制能力的影响进行了研究。以AT1质粒为骨架，先后构建了T369V、A371V、T369V+A371V、TAMs+T369V、TAMs+A371V、TAMs+T369V+A371V、T369I、T369I+A371V、TAMs+T369I+A371V等突变组合，包装病毒后，将等量的病毒分别与AT2共感染PM1细胞，在感染后的第3、4、5、6天分别取样，采用流式细胞仪计算被两种病毒感染的细胞数目，和占总细胞的比例。结果发现T369V和T369I突变单独出现就可以导致病毒复制适应性下降95%以上，提示这两种突变在感染者体内会造成较低的病毒载量。.二、构建了表达耐药病毒P66和P51的表达质粒.为研究耐药突变对病毒RT酶功能的影响，我们构建了含有TAMs、TAMs+T369V、TAMS+A371V、TAMS+T369V+A371V四种突变的p66和p51真核表达质粒，在大肠杆菌BL21中获得高效表达。为进一步开展针对酶学的功能研究提供了平台。.三、构建了第一个具备高复制能力的CRF07_BC亚型感染性克隆.将一株具有高复制能力的CRF07_BC分离株XJDC6291全基因组克隆入低拷贝载体Plg338,并通过替换膜区，获得了2株高感染性的CRF07_BC全基因组克隆，该两种感染性克隆为CCR5嗜性，在PBMCs上的复制水平可以达到1500ng/ml,远大于已构建的C和BC亚型感染性克隆，且发现V1V2区域的多态性对病毒的侵入能力有着较大的影响。.四、针对BC亚型的嗜性转变开展了研究.我们利用BC亚型感染性克隆，对所有文献报道过可以导致C亚型嗜性转换的位点进行逐一突变，产生的病毒失去了感染性或未完成嗜性转变，而将携带突变的BC V3环移植到B亚型克隆pNL4-3上时，部分重组病毒展示出了CCR5嗜性，提示V3以外的区域也可能决定BC亚型的嗜性。最后，我们发现V1V2联合V3区突变可以使BC亚型病毒完成嗜性转换，提示CRF07/08BC具有较高的遗传屏障是病毒不容易发生嗜性转变的原因之一。