新城疫病毒M蛋白核定位信号突变影响病毒复制增殖的作用机制

Numerous studies have shown that the nuclear localization of viral proteins mediated by nuclear localization signal (NLS) plays crucial roles in the replication and proliferation of viruses. The M protein of Newcastle disease virus (NDV) is demonstrated to localize in the nucleus via its own NLS, which is essential for the nuclear localization characteristics of M protein. We previously rescued the NDV carrying M/NLS mutation using reverse genetics and found that the replication and proliferation ability of the mutant NDV dropped significantly when compared to the wild-type NDV. However, the mechanism of the effect of M/NLS mutation on the replication and proliferation of NDV remains unknown. This project planned to study the effect of M/NLS mutation on the biological characteristics, the level of genome replication and transcription, and the efficiency of assembly and budding of NDV; screen and analyze the differentially expressed proteins derived from M/NLS mutant and wild-type NDV infected cells. Moreover, the function of these proteins in the replication and proliferation of NDV was verified. The results obtained from the project could reveal the mechanism of the obvious reduction of NDV replication and proliferation affected by M/NLS mutation. The research work will be of great importance in understanding the function of M’s nuclear localization, and studying the role of M protein in the replication and pathogenic mechanism of NDV.

许多研究表明，核定位信号（NLS）介导的病毒蛋白细胞核定位对病毒复制增殖具有重要作用。新城疫病毒（NDV）M蛋白是病毒感染期间唯一能通过自身携带的NLS进入细胞核的病毒蛋白，对NLS中关键氨基酸位点突变可以破坏M蛋白的细胞核定位特征。我们前期利用反向遗传操作技术拯救出M蛋白NLS突变的NDV，初步研究发现与野生型病毒相比，突变体病毒的复制增殖能力显著下降，但是这种作用机制尚不清楚。本项目拟通过研究M蛋白NLS突变对NDV生物学特性、基因组复制转录水平以及病毒装配和出芽效率的影响，筛选和分析M蛋白NLS突变型和野生型NDV感染细胞后的差异表达蛋白，并对其在NDV复制增殖中的作用进行功能验证，以此阐明M蛋白NLS突变影响NDV复制增殖的作用机制。本研究工作的开展对我们深入了解NLS介导的NDV M蛋白细胞核定位功能、研究M蛋白在NDV复制和致病机制中的作用具有重要意义。

课题组前期研究发现，M蛋白核定位信号（NLS）突变的新城疫病毒（NDV）在细胞中的复制能力显著下降，但是其作用机制尚不清楚。本项目首先证实M蛋白NLS突变显著降低了NDV的毒力和致病性，并且NLS突变使M蛋白丧失了细胞核-细胞质穿梭特征，导致突变体NDV的基因组复制、转录和翻译水平也发生了明显下降。进一步利用TMT定量蛋白质组学研究病毒感染BSR-T7/5细胞后的差异表达蛋白，结果发现亲本NDV和突变体NDV感染细胞后的12 h和24 h分别有484和466个、109和104个差异表达蛋白，其中仅有7个差异表达蛋白是两个病毒在两个时间点共有的蛋白；亲本NDV感染细胞后大量的M蛋白早期聚集在细胞核能抑制细胞转录、RNA加工和修饰、蛋白质合成、蛋白质翻译后修饰和蛋白质转运等过程，而突变体NDV感染引起的抑制作用明显减弱。我们选取表达量上调或下调差异显著的3个细胞蛋白TIFA、BRD2和RPL18，研究其在NDV复制中的作用。研究结果显示，M蛋白在细胞质中能以剂量依赖的方式降低TIFA蛋白的表达，并通过下调TIFA/TRAF6/NF-κB信号通路产生的细胞因子来促进NDV的复制。另外，我们还发现M蛋白与BRD2蛋白在细胞核中存在相互作用，并通过降低BRD2蛋白的表达来促进NDV基因组的复制和转录以及NDV的复制；而M蛋白与RPL18蛋白虽然不存在相互作用，但是M蛋白却能通过上调RPL18蛋白的表达来增强病毒蛋白的翻译和病毒的复制效率。以上研究结果表明，M蛋白NLS突变使M蛋白过早的定位在细胞质，降低了NDV基因组的复制、转录和翻译水平，以及对细胞基因转录翻译和抗病毒免疫应答方面的抑制能力，从而影响了NDV的复制和致病性。本项目揭示了NLS介导的M蛋白细胞核-细胞质穿梭在NDV复制和致病性中的重要作用，为后续深入研究M蛋白在NDV和其它副黏病毒复制与致病机制中的作用提供了重要参考和理论依据。