我国部分地区HIV耐药毒株的分子进化及复制适应性研究

本课题首先在河南和广西分别建立长期和初始接受抗病毒治疗的艾滋病病人共约600人的研究队列，进行随访，通过对访谈和实验室检测数据（病毒载量、CD4细胞计数、基因型和表型耐药等）的分析，阐明长期和初始治疗病人中耐药的发生发展规律。以从队列中获得的系列血液样本为材料，通过病毒的有限稀释克隆培养、系列RT-PCR产物的大量克隆测序，阐明耐药突变的进化路径、选择动力学特征及其影响因素。对分离的典型耐药毒株，采用单周期感染实验、竞争性生长实验等测定复制能力和复制适应性；通过定向诱变构建携带系列突变的恢复病毒，分别测定它们的表型耐药性和复制适应性，评估各种突变对耐药的贡献和对复制适应性的影响。最后综合全部研究结果，概括耐药毒株的传播和致病特征、耐药突变的选择动力学和分子进化规律，为针对耐药性毒株的防治基础研究（疫苗和药物等）奠定基础，为制定耐药病人的治疗策略、认识耐药毒株的流行特征和趋势提供科学依据。

一、背景：药物压力下HIV快速产生耐药性，耐药毒株正在传播和流行。.二、目的：了解我国耐药毒株的分子进化和复制特征，为防控耐药毒株奠定基础。三、开展的工作及产出的主要结果： .（一）建立队列和流行病学研究：在河南临颍、镇平、沈丘和广西贺州，建立了734名初治患者队列、随访2015人次；延续横断面和封闭式队列研究，调查263人次。（1）估算出耐药发生时间（50%患者保持药物敏感的时间）、不同病毒载量患者的耐药发生时间以及对两类药物发生耐药的时间中位数、耐药对临床转归和预后的影响。（2）计算出各类耐药毒株的流行率。（3）筛选和鉴定了7个新型耐药相关突变位点。.（二）采用新的研究方法揭示了多种耐药毒株的分子进化路径：（1）建立了等位基因特异实时荧光定量PCR（Allele-Specific real-time PCR，ASPCR）检测5个常见耐药突变的方法。测定了140份血浆标本中的5种耐药毒株，揭示了血浆中耐药准种的存在状态和变化特点。（2）建立了单基因组扩增（Single-Genome Amplification，SGA）测定HIV-1准种序列的方法，确定了蛋白酶抑制剂（IDV）的耐药进化路径。（3）建立体外加压诱导耐药毒株、测定病毒基因序列的方法，鉴定出5种药物的体外选择耐药进化路径。（4）采用克隆测序法获得来自6名长期治疗患者系列血浆和PBMCs标本的1588条pol基因序列，阐明血浆和PBMCs中耐药准种的分布和变化规律。.（三）揭示各种突变对耐药的作用及耐药株的复制能力和适应性特征：（1）获得稳定传代的病毒34株。（2）对12株病毒对5种常用药物的敏感性进行测定，明确了Y181C和/或H221Y在6种突变或突变组合的基础上对5种药物耐药的贡献。（3）采用竞争性复制适应性实验和体外病毒生长试验，鉴定了耐药毒株的复制能力和适应性。发现携带Y181I的耐药株和携带V179E/Y181C/T215Y的毒株具有显著复制优势。.四、主要结果的科学和应用意义：建立和使用了多种具有应用意义的检测或研究方法；揭示出对于耐药预测、预防具有指导意义的耐药发生和流行规律；加深和丰富了对多种耐药突变的认识；对于耐药进化路径有了新的或深入的理解；发现了复制能力超过野毒株的耐药毒株，应有效防范。.五、论文、专利、人才培养.发表论文13篇、正在撰写3篇。申请专利3项、授权2项。培养研究生7