无抗冻剂超快速冷冻兔睾丸/附睾精子对ICSI胚胎及子代印记基因IGF2/H19表达及甲基化的影响

At present, rapid freezing is widely applied in the semen cryopreservation for the patient of azoospermatism in ART. But rapid freezing is recognised with complex, low post-thawing sperm motility and toxic effect. It has previously been shown that injection with the sperm of complete nucleus into oocyte can generate embryo and offspring. The dynamic sperm is selected and immediately plunged into liquid nitrogen, and we termed the procedure as snap freezing without cryoprotectants. It has been reported that this method could be used to produce offspring in animals, but there was no in-depth investigation on embryo implantation, live birth rate and epigenetics. Our previous studies have shown that there was no significant difference in the fertilizing capacity and embryonic development between the group of snap freezing without cryoprotectants and the group of rapid freezing, and we have further got offspring by this method. In order to further verify the safety of this method in clinical application, we would to establish rabbit model to explore the effect of snap freezing without cryoprotectants on the embryo implantation and live birth rate, at the same time, the imprinted genes of IGF2 and H19, which are closely related to embryonic development, are selected to explore the effect of snap freezing without cryoprotectants on the expression and DNA methylation in the preimplantation embryos, placenta and the tissue of the offspring. We expect this research could provide a certain theoretical basis for the method in clinical application.

目前辅助生殖技术（ART）中无精子症患者睾丸/附睾精子冻存主要使用快速冷冻法，但该法流程复杂、复苏率低、有抗冻剂毒性，研究表明卵胞浆内单精子注射（ICSI）的应用使得只需将含完整细胞核的精子头注入卵母细胞就能形成胚胎并发育为个体。无抗冻剂超快速冷冻是选取有活力的精子直接投入液氮保存，已有文献表明该冻存方法能在动物上获得活产子代，但未对胚胎着床、活产及表观遗传情况做深入探讨。本团队前期结果表明无抗冻剂超快速冷冻兔精子与快速冷冻组对比受精能力不受影响、植入前胚胎发育能力无显著差异，且获得了子代。.为验证该方法在临床上应用的安全性，本研究拟以兔为模型，探讨无抗冻剂超快速冷冻兔睾丸/附睾精子对胚胎着床、活产的影响，同时选取与胚胎发育密切相关的印记基因IGF2/H19为研究对象，探讨该方法对植入前胚胎、胎盘及子代组织印记基因IGF2/H19表达和甲基化的影响，为该冻存方法临床应用提供一定的理论依据。

目前辅助生殖技术是不孕症患者获得后代的有效手段，但它所带来的婴儿健康问题正引起研究者广泛的关注。研究表明印记基因在整个胚胎发育中起着至关重要的作用，同时又易受外界环境的影响，因此探讨辅助生殖及其衍生技术对胚胎及子代印记基因的影响尤为重要，IGF2/H19作为影响胎儿生长、胎盘发育并为胎儿提供更多的营养、增加胎儿存活机会的印记基因对胚胎的发育、存活、子代健康有着重要的意义。精液保存是辅助生殖技术中一项重要衍生技术，各种抗冻剂作为精液保存中重要的添加物质，均具有不同程度细胞毒性，其对子代的深远影响暂时未知。无抗冻剂超快速冷冻精子技术作为一种方便、快捷、无胚胎毒性的冷冻技术，在动物上能够获得后代，但未有更加深入的研究。因此研究无抗冻剂超快速冷冻精子技术与IGF2/H19的相关性在临床上非常有必要性。研究团队通过电镜对无抗冻剂超快速冷冻附睾精子进行形态学扫描、DNA损伤进行探讨，进一步通过ICSI技术对冷冻复苏的附睾精子进行胚胎发育能力进行了探索，并通过胚胎移植获得子代，进而对卵裂期胚胎、囊胚及子代组织进行了印记基因IGF2/H19表达和甲基化水平变化做了分析。研究结果表明无抗冻剂超快速冷冻存精子与快速冷冻精子相比，并没有明显的形态学损伤，而且无抗冻剂超快速冷冻精子对精子DNA的损伤更小。ICSI生产的胚胎发育实验中，总受精率并无显著差别，但是2PN受精率、卵裂率以及2PN囊胚率，无抗冻剂超快速冷冻精子组显著低于快速冷冻组，但是胚胎发育潜力仍然比较可观，而且胚胎移植能正常获得子代，最后，对植入前胚胎及子代组织进行印记基因IGF2/H19分析结果显示，无抗冻剂超快速冷冻精子IGF2和H19 mRNA的表达虽然有显著变化，但是并不显著改变IGF2/H19 ICR片段的甲基化水平。上述结果表明，同传统的带有抗冻剂的快速冷冻精子相比，无抗冻剂超快速冷冻精子并不影响IGF2/H19 基因的甲基化水平，是一种方便的、安全的、经济实惠的精子冷冻保存方法，是适用于临床的潜在精液冻存方法。