基于DNA甲基化介导的IGF2/H19基因印记调控通路探讨芪芎方治疗大鼠弱精子症的作用机制

Male infertility is a common disease in andrology patients, and asthenospermia is one of the main causes of male infertility. Latest research showed that DNA methylation was closely related to occurrence of asthenospermia. In the clinical practice，our research team found that Qi Xiong Fang was effective on asthenospermia significantly compared with sham group, which can improve sperm motility safely. With these precondition, now the hypothesis is proposed: sperm DNA methylation disorder is one of the main causes of asthenospermia,which induced.infertility, and Qi Xiong Fang treat asthenospermia by regulating sperm DNA methylation. A generally recognized rat model is employed, then the model rats cerceive administration of Qi Xiong Fang. Samples of sperm are prepared and the vitality are tested respectively. Sperm DNA methylation is determined by BSP, combined with staining and pathological tests on structure change of testis and epididymis. This proposal aims at exploring mechanism of Qi Xiong Fang for asthenospermia both from morphology and DNA expression, and will lay a.pharmacological foundation for "nourishing Kindney, generating Essence and activating Blood"Chinese medicine on asthenospermia treatment.

男性不育症是临床常见病，弱精子症是导致男性不育症的主要原因之一。弱精子症的最新研究表明，精子DNA甲基化异常与弱精子症的发生密切相关；结合课题组前期临床观察，发现补肾生精活血中药芪芎方治疗弱精子症安全有效，能够提高精子活动力。从而，本课题提出假说：精子DNA甲基化异常是引起弱精子症从而导致男性不育的原因之一，芪芎方是通过干预DNA甲基化信号通道治疗弱精子症。课题采用目前较公认的弱精子症大鼠模型，给予芪芎方干预后，观察大鼠精子活动力，以亚硫酸氢盐克隆测序法检测精子印记基因CpG岛甲基化，结合染色、光镜观察睾丸、附睾组织结构变化，从病理结构和DNA表达水平揭示芪芎方治疗弱精子症的可能作用机制，为补肾生精活血法治疗弱精子症提供进一步的理论基础，为临床男性不育症的治疗提供参考。

男性不育症是临床常见病，弱精子症是导致男性不育症的主要原因之一。弱精子症的最新研究表明，精子DNA甲基化异常与弱精子症的发生密切相关；结合课题组前期临床观察，发现补肾生精活血中药芪芎方治疗弱精子症安全有效，能够提高精子活动力。从而，本课题提出假说：精子DNA甲基化异常是引起弱精子症从而导致男性不育的原因之一，芪芎方是通过干预DNA甲基化治疗弱精子症。课题组采用奥硝唑造模弱精子症大鼠的方法制备大鼠模型，使用芪芎方干预，通过精液参数、睾丸病理、精子DNA甲基化水平等评价芪芎方治疗大鼠弱精子症疗效，探讨其治疗机制。结果显示，采用奥硝唑成功造模弱精子症大鼠模型，各组大鼠肝、肾功及性激素水平均无差异。芪芎方中、高剂量组能提高弱精子症大鼠精液PR、NP、PR+NP水平，差异具有统计学意义（P＜0.05），且芪芎方各组均可对弱精大鼠受损的生精细胞起到修复作用，其中芪芎方中、高剂量组效果更显著。通过限制性内切酶—重亚硫酸盐靶向测序(RRBS)技术，课题组对6组大鼠的精子DNA全基因组甲基化进行比较，发现模型组与空白组相比有大量异常的高甲基化基因，同时还有较多的低甲基化基因，通过Go与Pathway分析得出这些异常的高甲基化基因与低甲基化基因涉及多通路；同时发现芪芎方低、中、高剂量均能减少异常的高甲基化基因，增加低甲基化基因，且可下调H19 DNA甲基化水平。结论：芪芎方显著提高大鼠精子活力，可调节DNA 全甲基化水平和H19甲基化水平，这提示芪芎方治疗弱精子症的的机理可能是对弱精子症异常高甲基化及低甲基化的双重调控作用，即以去甲基化为主，促甲基化为辅，并可修复奥硝唑所致弱精大鼠的生精细胞。本课题为补肾生精活血法治疗弱精子症提供进一步的理论基础，为临床男性不育症的治疗提供参考。