人精子印记基因H19甲基化突变的遗传消除机制研究

An increase of imprinting disorders in children conceived though assisted reproductive technologies (ARTs) has been addressed by several reports. The transmitting of imprinting errors from sperm of infertile father is thought to be a possible reason for the increased disorders. However, it has been suggested by our and others previous study that the frequency of imprinting errors is low in offspring through ICSI, and increased imprinting errors in sperm of infertile patient do not have an obvious influence on ART outcomes and the imprinting of offspring. Thus, there might be a eliminating mechanism for these imprinting errors during fertilization and/or early embryo development. But little is known about the mechanism. In this study, we are going to distinguish the origin of allel and embryo for H19 sequencing results, and to test embryos from different patients together to increase DNA abundance. We will study the relationships between H19 imprinting aberrances from sperm and fertilizing ability of spermatozoa, embryo development potential, cell differentiation and methylaiton of maternal allel, to establish the imprinting patterns of H19 through early embryo development, and to investigate the eliminating mechanisms of sperm imprinting errors.

基因印记异常与BWS、SRS、AS等多种生长发育疾病相关。男性不育患者精子基因印记异常发生率高。基因印记在配子发生时期建立，不参与早期胚胎基因组DNA甲基化重建，因此通过IVF/ICSI技术，精子中的印记基因甲基化突变可能遗传给子代。然而我们前期工作及他人报道发现，印记异常在男性不育后代中发生率不高，精子DNA印记异常对试管婴儿临床结局和子代印记甲基化无明显影响。说明在受精和/或胚胎发育过程中存在印记异常的消除机制。在本研究中，我们拟基于父母双方在甲基化区的SNP确定H19甲基化的等位来源和胚胎来源，并把可确定来源的不同患者胚胎一起检测，提高每个反应的DNA丰度。通过在单胚胎水平研究精子来源的H19印记异常与受精能力、胚胎发育潜能、细胞分化、母源等位甲基化水平的相关性，明确H19在早期胚胎发育过程中的印记变化模式，探讨精子来源的印记基因甲基化突变的消除或纠正机制。

我们前期工作及他人报道发现，男性不育患者中高发的印记异常在后代中发生率不高，精子DNA印记异常对试管婴儿临床结局和子代印记甲基化无明显影响,说明在受精和/或胚胎发育过程中存在印记异常的消除机制。为探讨印记基因的遗传机制，本研究通过单细胞转录组和甲基化组测序，系统分析了人印记基因在早期胚胎发育及细胞分化过程中的表达及甲基化模式，通过生物信息学分析我们的以及已发表的测序结果，发现胚胎发育早期H19基因在所有细胞中均呈现低表达,显著低于成体细胞；但随着细胞分化，在不同类型细胞中H19以及其他印记基因的表达存在显著性差异，滋养层细胞中H19表达异质性高于多潜能外胚层和原始内胚层。H19在D6-D10胚胎中甲基化水平呈上升趋势，在D10胚胎不同分化细胞中甲基化水平开始出现差异。通过单细胞甲基化技术，我们还发现受精潜能高的透明带结合精子与人为挑选精子相比，总体甲基化率低（P<0.01），H19甲基化水平较高（95.0±2.2% vs89.9±4.8%），而通过卡方检验同一样本的透明带结合精子和人为挑选精子，4份精液中有3份透明带结合精子甲基化的CpG位点显著多于人为挑选精子。反复种植失败患者精子与成功活产患者精子样本相比，在H19第一个内含子和第二个外显子区域存在显著甲基化区域（1997500-1998600），该区域反复种植失败样本的甲基化水平显著低于对照（P<0.05）。以上结果说明，在受精、胚胎发育、细胞分化和着床过程中夫源H19甲基化异常被逐步消除。此外，该项目在比较透明带结合精子和人为挑选精子甲基化水平时，还发现甲基化差异区域（DMR）相关在神经发育相关的生物过程中聚集，进一步分析1003个自闭症备选基因发现，在这些基因中DMR相关基因比例显著高于匹配的背景基因(47.8% vs 37.1%,p<0.001)，并发现该差异主要是由于自闭症基因中较高比例的二价体结构导致的。该结果为“ICSI中使用的精子未经自然受精严格的筛选，可能导致子代致病风险升高”的假说提供直接证据，具有较高的临床应用价值。