宫内高糖环境对雄性子代生殖细胞Igf2/H19基因印记的影响及其机制研究

Intrauterine hyperglycemia environment of gestational diabetes mellitus (GDM) has been confirmed to increase risk of diabetes in offspring beyond genetic factors. Intrauterine hyperglycemia environment also increase the risk of impaired glucose tolerance in the second filial generation of mice. However, the mechanism of transgenerational transmission remains to be studied. Our team previously found abnormal imprinted gene Igf2/H19 expression in the sperm of the first filial generation of GDM mice, which suggests us focus the concern of the onset of diseases at the phase of gametogenesis, investigating the effect on imprinting reprogramming of germ cells in male offspring. The project will use animal model, examine the level of Igf2/H19 expression and methylation status of differential methylation region (DMR) of germ cells of different stages in male fetus; detect the levels of DNA methyltransferase （DNMT1, DNMT3a，DNMT3b）in hyperglycemia environment to explore whether the mechanism of methylation change is associated with abnormal expression and regulation of DNMTs; use in vitro cell culture, apply technology of transfection and siRNA, correct abnormal key enzymes for methylation regulation; analyze the attenuation of adverse effect after improving abnormal methylation modification. We are in the hope of revealing the probable mechanism of transgenerational effect of intrauterine hyperglycemia environment, providing theory basis for controlling the transgenarational influence by intrauterine adverse environment at the source.

妊娠期糖尿病（GDM）宫内高糖环境已证实在排除遗传因素后增加子代患糖尿病风险，宫内高糖环境还增加子二代小鼠糖耐量异常的风险，但此隔代效应机制仍有待研究。本实验组前期发现GDM子一代小鼠精子印记基因Igf2/H19表达异常，提示我们将发病关注点前移至配子发生期，研究对雄性子代生殖细胞印记重编程的影响。本项目将利用动物模型，检测GDM子一代雄性胎鼠不同阶段生殖细胞中Igf2/H19表达水平及相应差异甲基化区（DMR）甲基化状况；检测高糖环境下甲基转移酶（DNMT1，DNMT3a，DNMT3b）的水平，研究Igf2/H19 DMR甲基化改变的机制是否由DNMTs表达调控异常所致；进行体外细胞培养，应用转染及siRNA技术，纠正异常甲基化调控关键酶，比较分析改善甲基化修饰异常后对不良影响的消减作用；揭示宫内不良环境所致隔代效应的可能发生机制，为宫内高糖环境所致隔代发病效应实现源头控制提供理论基础。

研究背景和方向： "胎儿编程"学说的提出，使胎儿源性成人疾病成为现代医学的研究焦点。妊娠期糖尿病，已被证实在排除遗传因素后增加子代疾病风险，但发病机制不清。本研究在前期研究发现GDM小鼠宫内高糖环境致隔代效应及子一代雄鼠精子印记基因Igf2、H19表达异常的基础上，研究宫内高糖不良环境是否通过影响印记调控关键酶DNMTs的表达及活性，干扰生殖细胞印记重建过程，从表观遗传调节层面阐明高糖环境对胎儿发育的影响机制。.研究内容：1. 建立妊娠期糖尿病（GDM）小鼠模型，获取对照组及宫内高糖环境下雄性胎鼠不同阶段生殖细胞。2. 雄性胎鼠不同阶段生殖细胞Igf2、H19以及DNMTs表达水平检测，并对18.5dpc的睾丸组织进行表达谱芯片检测。3. 雄性子代不同阶段生殖细胞DMR甲基化状况分析。4. PGCs体外培养, 比较分析了高糖环境培养下Igf2/H19和DNMTs的改变，验证高糖环境影响生殖细胞甲基化调控的直接效应。.研究结果和结论：1. GDM子代雄性胎鼠13.5dpc原始生殖细胞及18.5dpc精原细胞中Igf2及H19表达均降低，睾丸组织表达谱186个基因上调，246个基因下调（Fold Change>2 & p<0.001）。2.GDM子代精子细胞甲基化状态改变的区间1009个，其中上调609个，下调410个，与基因表达、转录后修饰、神经系统发育、代谢性疾病等密切相关。3. GDM组雄性胎鼠13.5dpc原始生殖细胞中Dnmt1，Dnmt3a，Dnmt3b均表现为增高趋势，18.5dpc精原细胞中Dnmt1，Dnmt3a表达下降，而Dnmt3b表达仍明显增高，可能是导致异常甲基化状态的机制之一。4.电镜观察GDM组精原细胞线粒体大小各异，线粒体嵴肿胀，出现空泡,出现异型核，糖原堆积，内质网肿胀。5.PGCs体外高糖培养，发现Igf2/H19和DNMTs表达改变，验证了高糖环境影响生殖细胞甲基化调控的直接效应。