毛蕊花糖苷对阿尔茨海默病APP/PS1双转基因小鼠的神经保护作用及机制研究

Alzheimer's disease (AD), the most common type of senile dementia, causes great threats to the public health. Nowadays, management of AD is still a challenge as no effective strategies are available. Recently, extensive studies have been conducted in the research and development of new natural drugs. Phenylethanoid glycosides from Cistanche with the potency of prevention and treatment for AD has been widely confirmed especially acteoside. Our previous study has suggested that the extract of phenylethanoid glycosides from cistanche could significantly improve the learning and memory of AD model. In addition, acteoside plays crucial roles in the neuron protection. Based on results, this project aims to investigate the effects of acteoside on AD in APP/PS1 double transgenic mice. Spatial learning and memory of mice were tested by Morris water maze to evaluate the therapeutic effects of acteoside on cognitive function. The regulative effects of phenylethanoid glycosides on the memory and behavior in AD mice, based on which to develop new drugs based on phenylethanoid glycosides. Our study could provide helpful information for the research and development of new drugs against AD.

AD是老年痴呆最常见类型，近年来发病率显著上升，对患者、家庭、社会危害极大。目前尚缺乏有效治疗手段，从天然产物中发掘新药已成必然。肉苁蓉苯乙醇苷特别是毛蕊花糖苷具有防治AD的潜能已被广泛证实，课题组前期研究也显示：肉苁蓉苯乙醇总苷能显著改善AD模型动物学习记忆；后续研究又对肉苁蓉苯乙醇苷单体保护神经细胞作用进行活性筛选，发现毛蕊花糖苷作用最强。基于前期研究基础，本项目拟采用现代药理学和分子生物学技术，借助APP/PS1双转基因AD动物模型，对抗AD作用确切、活性筛选作用最强、肉苁蓉中含量较高的毛蕊花糖苷的抗AD作用进行深入研究，于分子层面研究其对引起AD发病的基因转录水平、蛋白表达情况影响，于整体动物层面研究其对模型小鼠学习记忆、行为能力影响，综合分析，以阐明苯乙醇苷抗AD作用机制。通过本项目研究，力求发现新的治疗AD天然药物，为开发以苯乙醇苷为母核结构的新型抗AD药物提供理论依据。

本项目围绕毛蕊花糖苷的抗AD作用及机制展开了深入研究。综合系统文献调研和课题组前期研究基础，不断优化完善研究方案，在项目实施的4年期间，按照原定计划：（1）优化构建以大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞（PC12）细胞为模型载体，基于Aβ假说和氧化应激假说的2种AD离体模型，考察了毛蕊花糖苷和肉苁蓉苯乙醇总苷对细胞的保护作用。结果显示Aβ1-42损伤模型最佳损伤条件为0.5μM造模浓度损伤48h，H2O2损伤模型最佳损伤条件为以PBS为溶媒、25μM造模浓度损伤24h。肉苁蓉毛蕊花糖苷干预组可使细胞存活率明显升高，LDH渗漏率减少，MDA含量降低（p<0.05）。（2）构建APP/PS1双转基因AD小鼠在体研究平台，考察了毛蕊花糖苷和肉苁蓉苯乙醇总苷对模型小鼠行为和学习记忆能力的影响。研究结果表明毛蕊花糖苷可提高小鼠筑巢分数，缩短逃避潜伏期，降低跳台错误次数，游泳轨迹呈直线型或趋向性，明显改善AD模型小鼠认知功能障碍。（3）开展了毛蕊花糖苷和肉苁蓉苯乙醇总苷防治AD药效学研究并考察其对胰岛素信号转导通路相关基因和蛋白表达情况的影响，阐明了其拮抗AD具体作用机制。研究结果表明肉苁蓉毛蕊花糖苷能够改善模型小鼠海马神经元的损伤；海马CA1区Aβ1-42、Aβ1-40、InR、IRS-1、IGF-1R阳性细胞数显著减少；下调InR、IRS-1、IGF-1R蛋白表达，上调PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT蛋白表达（p<0.05）。（4）在明确毛蕊花糖苷是肉苁蓉发挥抗AD作用的主要药效物质基础后，采用高速逆流色谱法成功制备毛蕊花糖苷等肉苁蓉苯乙醇苷系列单体。研究结果表明HSCCC两相溶剂体系为乙酸乙酯∶正丁醇∶乙醇∶水=40∶6∶6∶50、流速1.5mL/min、转速900r/min、温度25°C、检测波长333nm；HPLC色谱柱为COSMOSIL 5C18-PAQ（4.6mm ×250mm，5μm）、柱温30°C、流动相：甲醇（B）-0.04%磷酸水溶液（A）、等度洗脱（35%B，65%A）、流速1.0mL•min-1；分离出松果菊苷、肉苁蓉苷A、毛蕊花糖苷、2，-乙酰基毛蕊花糖苷四个成分。综上所述，本项目从细胞分子水平、整体动物层面探讨了肉苁蓉毛蕊花糖苷抗AD具体作用机制，为开发以苯乙醇苷为母核结构的肉苁蓉抗AD新药奠定研究基础。