Wnt与TP53信号通路在斑马鱼原发性肝癌发生发展中的协同作用

Hepatocellular carcinoma (HCC) is the second most common malignant tumors in China，and most HCC cases are ultimately attributed to the genetic deregulations that are highly conserved in the vertebrate kingdom，therefore it is ideal to use model animals to study HCC. Currently, we have a zebrafish HCC model via the liver-specific overexpression of Myc，provided by our collaborating researchers. Recently, many clinical whole genome sequencing data suggest that the Wnt and TP53 signaling pathways are most relevant to human HCC. To investigate the synergistic roles for the Wnt and TP53 signaling pathways in hepatic tumorigenesis and hepatocarcinogenesis, and to optimize the zebrafish model of HCC in term of genetic similarity, we will pursue three directions based on our established model: 1) To perform a realtime “4D” observation of zebrafish hepatic tumorigenesis, and to figure out the spatio-temporal alternations of the Wnt and TP53 signaling pathways as well as their relevant cellular behaviors; 2) To combine the current Myc model with APC and TP53 mutants, to make it similar to human HCC at genetic level, and to investigate the synergistic effects among those genes on HCC formation and progression at cellular and molecular levels; 3) To create conditional inducible Wnt-activated and TP53-inactivated transgenic zebrafish lineages, and use those potential zebrafish HCC models to screen and evaluate the small molecules that can be used for therapy in humans.

肝癌（HCC）是我国当前第二大恶性肿瘤疾病，其发生发展与一系列在脊椎动物中高度保守的遗传学调控失常相关，因而适合运用模式生物模型开展研究，我们目前已有一个基于Myc基因在肝脏中条件表达的转基因斑马鱼肝癌模型。最近大量临床全基因组测序结果表明人类肝癌中频率最高的基因突变发生在Wnt和TP53信号通路中。为了研究这些关键信号通路在肝癌发生发展中的协同作用，优化斑马鱼肝癌模型使其在基因型上更接近人类患者，本课题将以现有的斑马鱼肝癌模型为基础，从三个方面开展研究：1) 对斑马鱼肝癌的发生发展进行观测，探明其中Wnt和TP53通路及其对应的细胞行为的动态变化；2）将Myc肝癌模型同APC和TP53的突变鱼株组合，使其具备人类肝癌中常见的多基因性，以此研究Wnt和TP53通路在复杂肝癌发生发展中的分子细胞学功能；3）建立与Wnt和TP53通路直接相关的转基因肝癌模型，对其进行评估并进行小分子药物筛选。

.肝细胞癌的发生发展与多个保守通路的异常激活密切相关，适合运用模式动物对其进行模拟和研究。本项目以斑马鱼为主要工具，构建了多种肝脏特异性、剂量诱导型的转基因模型，对经典Wnt信号通路等主流致癌通路在肝癌发生发展中的协同作用进行研究。 ..通过构建新型多功能的双转基因系统，我们在斑马鱼的肝细胞中导入了人的突变型CTNNB1和鱼的tcf7l2，用于激活经典Wnt信号通路，其可以有效导致肝脏的增生和异常肿大。在将Wnt/Myc的激活型模型同Ras/Akt激活型模型结合后进行比较研究，我们发现不同癌通路显著差异性影响肝细胞的脂质组分。脂质组学研究表明，Ras/Akt的活性可以促进肝脏聚集大量的甘油三酯，而Wnt/Myc的共激活则可以促进甘油三酯向磷脂转变，并提高磷脂中不饱和脂肪酸链的含量，同时加速肝脏异常增殖的速度和抑制单纯Ras激活导致的细胞衰老现象。脂肪酸补充实验和药物筛选发现补充反油酸和棕榈酸或者通过药物如MK8245抑制脂肪酸去饱和化可以有效抑制斑马鱼肝癌模型的发生，同时也能抑制人肝癌细胞系的增殖。 ..有趣的是，我们发现肝癌模型中非肿瘤组织也有显著的表型，同时表达鼠Myc和鱼突变kras的双转基因斑马鱼肝癌模型可以迅速呈现恶病质的表型如厌食和正常组织过度消耗，伴随肝脏来源的瘦素水平急剧上升。敲除瘦素受体lepr或者其在中枢下游的效应受体mc4r可以部分缓解恶病质斑马鱼的厌食行为。lepr纯合突变和stat3抑制剂还可以显著挽救恶病质斑马鱼的肌肉和脂肪组织消耗，而mc4r突变则不可以。进一步的研究表明，高瘦素可以诱导正常脂肪和肌肉细胞发生胰岛素抵抗，而对肝癌细胞的胰岛素敏感性则作用较弱。进一步的在体药物筛选表明Napabucasin是缓解恶病质症状最为显著的Stat3小分子抑制剂。..综上，我们的研究展示了斑马鱼作为一种方便快捷的转基因肝癌模型的可行性和独特优势，其保留了脊椎动物在遗传和器官形态上的保守性，不仅可以被用于开展多信号通路协同作用机制的研究，还可以被用于研究肿瘤和非肿瘤器官之间的相互作用关系，尤其为探索肝癌个体中能量代谢调控提供了一种新的途径和工具。