人源Quiescin-sulfhydryl Oxidase1在蛋白质氧化折叠和质量控制中的作用

蛋白质二硫键异构酶PDI及巯基氧化酶Ero1是内质网中催化蛋白质氧化折叠最重要的酶系成员。近年来发现一类新的巯基氧化酶Quiescin-sulfhydryl oxidase(QSOX)，将 PDI和Erv1(线粒体中与Ero1相应的蛋白)这二类分子的基本结构单元融合于一个分子内部，但不清楚它是否独立于"Ero1-PDI"电子传递通路参与蛋白质的氧化折叠。由于重组蛋白纯化困难，对人源QSOX1的研究还停滞在起步阶段。我们优化了人源QSOX1的重组表达，已能够稳定获取蛋白，将全面鉴定分子的生化性质和生物活性；体外重构QSOX1催化蛋白质氧化折叠的电子传递链；采取基因突变结合酶动力学揭示QSOX1各结构域对生物活性的贡献，阐明分子内部的电子传递途径；研究QSOX1分子柔性和结构域间的相互作用；进行晶体生长、结构解析，解释其活性的结构基础；寻找QSOX1生理底物，揭示其细胞功能的分子机制。

二硫键对分泌蛋白和膜蛋白的结构稳定和功能行使至关重要。真核细胞内质网中，二硫键的形成主要由氧化酶Ero1/Erv2p和蛋白质二硫键异构酶(PDI)系统催化完成。QSOX同时具有类似Erv2p的Erv/ALR结构域和类似PDI的硫氧还蛋白(Trx) 结构域，能够直接氧化底物蛋白中自由巯基。我们重组表达并纯化获得了人源QSOX1b 蛋白。QSOX1b是一个高效的氧化酶，能够氧化二硫苏糖醇，还原型谷胱甘肽和还原变性的RNase A；但需通过PDI行使异构酶活力才能帮助还原变性的RNase A 完成氧化折叠实现复性。鉴定截短突变体，发现Trx结构域能够和底物发生巯基交换反应，而Erv/ALR结构域具有氧化酶的活力。截短突变体的组合并不能重建全长蛋白高效氧化自由巯基的酶活力，表明结构域间的共价连接对QSOX1b 分子内电子传递至关重要。通过半胱氨酸突变获得含有C41-C420二硫键的结构域间电子传递中间体，为QSOX1b中电子传递方向提供了直接证据。. Prx4是Peroxiredoxin 过氧化物酶家族唯一定位于内质网成员，能够清除内质网来源的过氧化氢(QSOX1和Ero1催化二硫键形成反应的副产物)。我们解析了人源Prx4三种不同氧化还原状态下的晶体结构，从而鉴定了其与过氧化氢的反应机制；揭示了催化反应中活性位点必须发生的构象变化和YF motif对这种构象变化的限制。Prx4对过氧化氢具有高反应性，但极易发生过氧化失活。我们发现去除YF motif或者将十聚体分子改造为二体能提高活性位点的柔性进而降低Prx4对过氧化失活的敏感。