Peroxiredoxin 4介导蛋白质氧化折叠通路的分子机制及结构基础

Disulfide bonds are essential for structure and function of most secreted and membrane proteins. Disulfide bond formation is often the rate-limiting step in the oxidative protein folding. In the Peroxiredoxin 4 (Prx4) mediate oxidative protein folding pathway, Prx4 utilizes H2O2 to oxidize protein disulfide isomerase (PDI), which then introduces disulfide bonds into nascent peptides. According to our previous work, Prx4 could directly react with folding substrates causing protein aggregation, and Prx4 could be inactivated by H2O2-induced over-oxidation. All these observations suggest that the Prx4 mediated oxidative protein pathway is more complicated than the recent liner model. In this project, we are going to reconstitute the Prx4 mediated oxidative protein pathway, study interactions between components, identify the regulation mechanism by over-oxidation of Prx4.We will try to solve the crystal structures of Prx4-PDI and Prx4-Srx complexes to provide a structural basis for this pathway. Identification of Prx4's partner proteins will be also performed to give a better understanding of the roles of Prx4 in the related diseases. This project will help us to comprehensively understand the oxidative protein folding in the endoplasmic reticulum in eukaryotic cells.

二硫键对蛋白质结构和功能有重要意义，其形成是蛋白质氧化折叠的限速步骤。Peroxiredoxin 4(Prx4)利用H2O2通过氧化蛋白质二硫键异构酶(PDI)最终催化新生肽链中的二硫键形成，是一条全新的蛋白质氧化折叠通路。申请者前期工作发现Prx4与进行氧化折叠的底物蛋白直接反应引起蛋白质聚集；Prx4易被过氧化而丧失酶活力,尚不清楚这是对Prx4功能行使的一种调节形式,以上说明这一系统远比现有的线性模型复杂。拟重构Prx4介导蛋白质氧化折叠通路，在原有线性模型的基础上引入Prx4直接与底物蛋白发生全新反应的 Off-pathway及过氧化对Prx4活力的调节环路。解析这一通路重要蛋白复合物如Prx4-PDI, Prx4-Srx的晶体结构，阐释这一通路工作的结构基础。鉴定Prx4相互作用蛋白以尝试建立其与相关疾病间的初步联系。此项目有助于全面认识真核细胞内质网蛋白质氧化折叠及其生理意义。

真核细胞分泌蛋白、膜蛋白的氧化折叠和质量控制主要在内质网进行。蛋白质二硫键异构酶PDI 分别同其上游Ero1、Prx4和GPx7/8组成多条蛋白质氧化折叠通路，确保蛋白质二硫键的正确形成。.Peroxiredoxin 4 (Prx4)清除内质网来源的H2O2的同时可氧化PDI参与蛋白质氧化折叠。我们发现了Prx4一种全新的反应形式。Prx4活性中心Cys87在被H2O2氧化形成-SOH 后能够直接与进行氧化折叠的底物蛋白反应形成二硫键连接的复合物，并引起强烈的蛋白质聚集。这代表了Prx4介导的蛋白质氧化折叠通路一种全新的off-pathway反应。PDI 可以发挥还原酶和分子伴侣活力有效地抑制这一反应及其产生的蛋白质聚集，保证蛋白质氧化折叠的有效进行。.Prx4不具备内质网滞留序列，其内质网定位依赖PDI家族分子伴侣ERp44。ERp44如何识别底物及ERp44与底物共价反应氧化力来源的问题，至今尚不清楚。我们发现ERp44不能与还原态的Prx4反应，只能与氧化态的Prx4 通过巯基-二硫键交换反应形成以分子间二硫键连接的复合物。该发现解释了ERp44和底物共价反应氧化力来源。我们解析ERp44-Prx4复合物2.6 Å分辨率的晶体结构，首次展示了ERp44结合生理底物的工作状态，揭示了ERp44特异性识别氧化态Prx4的结构基础，鉴定了多对在ERp44与Prx4分子识别中关键的相互作用。PDI家族成员可催化ERp44-Prx4共价复合物的还原解离，从而完成内质网滞留反应的循环。该工作揭示了内质网定位的蛋白质“巯基滞留”的分子机制。.PDI是参与内质网蛋白质氧化折叠的关键分子。基于人源PDI在不同氧化还原状态下晶体结构，我们开展了四种不同起始状态分子动力学模拟。在300 ns 时间尺度的模拟中，PDI单个结构域内部构象相对稳定，而不同结构域发生了相对位移。模拟终点都倾向形成较晶体结构更为紧凑的构象。我们系统分析了维持这一紧凑构象所需的结构域间相互作用。在这类PDI紧凑构象中，催化结构域a和a′活性中心非常接近。通过捕捉PDI两活性中心二硫键连接的中间体以及鉴定a和a′间的二硫键交换反应，我们首次为PDI两个活性中心间的电子传递提供了实验证据。破坏PDI紧凑构象的突变体，导致其还原酶活力降低。我们的分子动力学模拟和生化实验揭示了PDI自身固有的动力学性质及其生物学意义