聚合酶螺旋反应恒温扩增核酸的方法及其应用

We invented a new nucleic acid isothermal amplification method, namely Polymerase Spiral Reaction (PSR), this approach by targeting the two primers with a reverse each other's sequence, primer can be self as a template using spiral amplification of nucleic acid fragments large amounts of amplification. We have NDM-1 for target gene design two pairs of primers, at 63 ° c for 90 minutes you can complete the amplification reaction if supplemented by two speed primer isothermal amplification reaction amplification can be completed in 30 minutes, reaction product can be observed by means of electrophoresis, turbidity, stain, and other ways to judge. Aggregate enzyme spiral reaction except has other thermostat spread increased simple, and fast, and convenient, and sensitive, and specific, advantages zhiwai, also has itself of features, its introduction real design simple, and PCR introduction real design basic consistent; due to design introduction real by needed of target sequence more short, so on target sequence of requirements greatly reduced, especially applies virus of detection; can through indirect of method makes reaction results eye visible, especially applies clinical of bed next detection and disease controlled units of site fast detection. After initial progress, we need to be in the polymerase reaction model of spiral reaction and the reaction system, Primer Design, acceleration principle, results interpretation methods of conducting research.

我们发明了一种全新的核酸恒温扩增方法，即聚合酶螺旋反应，这种方法通过在两条引物的5’端加上一段互为反向的序列，可以使引物以自我为模板采用自螺旋扩增的方式将目标核酸片段大量扩增出来。我们以NDM-1基因为靶基因设计两条引物，在63℃保温90分钟便可以完成扩增反应；如果再辅以两条加速引物则恒温扩增反应在30分钟内变可以扩增完成，反应结果可以通过电泳、观察浊度、产物染色等方式来判断。聚合酶螺旋反应除了具备其他恒温扩增简单、快速、方便、敏感、特异等优点之外，还具有自身的特点，其引物设计简单，和PCR引物设计基本一致；由于设计引物所需的靶序列较短，所以对靶序列的要求大大降低，尤其适用于病毒的检测；可以通过间接的方法使反应结果肉眼可见，尤其适用于临床的床旁检测和疾控单位的现场快速检测。我们在初步取得进展后尚需在聚合酶螺旋反应的反应模型，反应体系，引物设计原则，加速原理，结果判读方式等方面开展研究。

我们发明了聚合酶螺旋反应(Polymerase Spiral Reaction, PSR)这一新型的核酸恒温扩增方法，它利用混合引物的设计思路，采用Bst DNA聚合酶的链置换活性及其扩增体系，通过引物结合、延伸、解链、单链旋转、再次延伸的循环，达到等温条件下核酸扩增的目的，PSR兼具PCR法引物设计简单和LAMP法只需一种酶、反应高效的特点，首次实现了一对引物和一种酶在等温环境下的核酸扩增。为进一步提高PSR法的反应速率，我们引入了加速引物的概念，通过添加加速引物可使得反应Ct值缩小到20min之内，在30min左右即可完成反应。此外，本研究采用了液体和固体封闭剂解决反应中可能存在的气溶胶污染问题，并优化了反应体系和引物设计参数，最终建立聚合酶螺旋反应这一新型的核酸恒温扩增方法。 . 本研究还构建了肺炎克雷伯菌、白色念珠菌、铜绿假单胞菌、肠道病毒71型、柯萨奇病毒A16型、霍乱弧菌这六种病原微生物的PSR检测方法，实验评估证实其具有良好的特异性和敏感性，并在临床考核中取得了良好成效。. 综上所述，本研究发明了聚合酶螺旋反应这一新型的核酸恒温扩增方法，具有良好的特异性与敏感性；解决了样本核酸提取和扩增结果判断繁琐、复杂的问题；建立了基于PSR反应的快速检测技术平台。我们认为PSR技术将为即时检测、应对新发突发传染病疫情及实验室常规的病原检测提供有力的技术支持，逐渐走向基层、走向家庭，最终让核酸检测随处可行。