聚合酶-内切酶扩增反应（PEAR）制备反义寡核苷酸

反义寡核苷酸能特异性调节基因表达，将成为新的基因治疗药物。商业化药物生产需要大量（以千克甚至吨计）的寡核苷酸。传统的化学合成法不仅成本高昂,而且需要使用危险化学品,加之产物纯化困难，规模难以扩大,十分不利于临床研究和大规模药物生产。本研究首创一种新型热循环酶促生物化学反应及核酸扩增方法-聚合酶-内切酶扩增反应（PEAR）技术。采用含有重复目标序列及酶切位点的双链DNA作为"种子"，通过独特的"滑动-切割机制"，用耐热DNA聚合酶延伸，耐热限制性内切酶切割,在热循环控制下扩增特定的目标寡核苷酸。PEAR扩增产物的分子数能够以指数模式持续增加，并且不受输入初始"种子"寡核苷酸分子数的限制。PEAR具有设备成本低、操作简便、高效和稳定很容易实现规模化和自动化的特点。PEAR扩增特异性高，产物十分易于纯化，纯化后产品的纯度极高。因而PEAR技术能够成为大规模，无污染的寡核苷酸药物生产的有用工具。

本项目已顺利完成了原计划科研目标，用聚合酶-内切酶扩增反应（PEAR）技术制备含有硫代、氟、及甲基修饰碱基的寡核苷酸。我们应用高效液相色谱和质谱联用技术（HPLC/MS）来检测PEAR扩增产物的相对分子质量，证明了修饰的PEAR产物的分子结构是正确的。PEAR反应是以“滑动-切割机制”为基础的，为了分析PEAR反应的动力学特性，建立PEAR反应的动力学模型，为PEAR扩增技术提供理论依据。最终确定底物（dNTPs）最大浓度为0.4mmol/L，而最佳浓度为0.2mmol/L。相应的产物最佳产量约为1.0µg/µL，也就是说PEAR每升反应液可生产寡核苷酸1.0g。为检测PEAR产物的生物活性，扩增制备、纯化了带有2’-氟修饰的miR-30a的反义寡核苷酸，导入了人类胃癌细胞，并用流式细胞仪检测胃癌细胞的死亡率和细胞凋亡率，证实了PEAR产物能成倍提高胃癌细胞的死亡率，具备很强的生物学功能。与化学合成法相比，PEAR方法在产物纯度上具有绝对优势。另外，PEAR的产物不需经过任何处理，可以直接作为下一轮PEAR扩增的“种子”，直到获得足够的产物。通过二次扩增和初步放大实验，说明PEAR技术具有易于放大的特性，能够成为大规模制备修饰寡核苷酸药物生产的有用工具。用PEAR技术制备修饰反义寡核苷酸，能够大大降低设备和材料成本，降低反义药物研究的门槛，促进反义药物研究的普及和应用。加上PEAR反应所用的酶为纯生物制剂，具有无毒、无污染、环保安全等特性，具有良好的应用前景。本项目目前已发表SCI论文2篇，已投稿论文3篇。本项目2009年4月3日提交了PCT国际专利申请，2012年分别进入中国和美国，目前已获得中国发明专利授权，美国专利进入最后审查阶段。