菲律宾蛤仔对无机砷的甲基化及其分子机制研究

Arsenic pollution in offshore area poses a serious threat to the survival of marine organisms and seafood safety. The toxicity of arsenic mainly depends on its species. Therefore, research on arsenic biotransformation is necessary so as to elucidate the toxic mechanisms and health risk of arsenic. However, there are few reports about the mechanisms of arsenic biotransformation in marine mollusks so far. Ruditapes philippinarum, an economically important species and widely used as environmental bioindicator, is used to investigate the molecular mechanisms of arsenic methylation in this project. The methylated-arsenic species and concentration in different tissues and subcellular fractions are determined with HPLC-HG-AFS to clarify the arsenic methylation in R. philippinarum. The genes encoding GSTΩ and AS3MT involved in arsenic methylation are cloned, and their molecular responses to inorganic arsenic exposure are studied. Then the recombinant proteins of GSTΩ and AS3MT are employed to investigate their in vitro functions during arsenic methylation. Moreover, the functions of GSTΩ and AS3MT are also validated with the arsenic-hypersensitive strain Escherichia coli AW3110. The results of this proposal will lay a foundation for elucidating the mechanism of arsenic biotransformation in marine mollusks, and also provide scientific basis for the establishmemt of seawater quality standard and the evaluation of potential health risk of eating seafood.

近岸海域的砷污染已对我国海洋生物的生存以及海产品的质量安全构成了严重威胁。由于砷的毒性与其赋存形态密切相关，因此开展砷的生物转化研究是揭示其毒性机制和健康风险的必要前提。迄今为止，有关海洋软体动物砷转化规律和机制的研究鲜有报道。本项目选取兼具环境指示功能和重要经济价值的菲律宾蛤仔为研究对象，围绕砷甲基转化规律及其分子机制开展研究。通过HPLC-HG-AFS技术，测定不同组织和亚细胞组分中甲基砷的赋存形态及其含量，明确菲律宾蛤仔对无机砷的甲基转化规律；获取砷甲基化关键酶GSTΩ和AS3MT的基因全长，并探讨其对无机砷胁迫的分子响应机制；实现GSTΩ和AS3MT的重组表达，体外验证其对砷的甲基化功能；结合砷超敏感菌株大肠杆菌AW3110，进一步确认关键酶的转化机制。研究结果可为海洋软体动物砷生物转化机制的阐明奠定重要基础，亦可为我国海水水质标准的制定以及海产品潜在健康风险的评估提供科学依据。

我国近海砷污染已对海洋生物资源和海产品安全构成了严重威胁。由于砷毒性与其赋存形态密切相关，因此查明砷在海洋生物中的富集转化规律是揭示其毒性机制和健康风险的必要前提。本项目选取兼具环境指示功能和重要经济价值的菲律宾蛤仔为研究对象，围绕砷甲基转化规律及其分子机制开展研究。本项目主要取得了以下研究结果：.通过HPLC-HG-AFS技术，测定鳃和肝胰腺组织中不同赋存形态的砷含量。结果表明，菲律宾蛤仔组织中砷的主要存在形式为AsB，其次为DMA，As(Ⅲ)、As(Ⅴ)和MMA占总砷的比例较小。受到无机砷暴露后，菲律宾蛤仔肝组织中总砷的积累量低于鳃组织，而肝组织中总砷积累的速度快于鳃组织。鳃组织能够快速将无机砷转化为DMA，而肝组织则将无机砷转化为AsB，进而发挥解毒功能。亚细胞分布结果表明菲律宾蛤仔主要将砷存储在生物解毒金属组分（BDM）中，其次为细胞碎片和金属敏感组分（MSF），从而更好地解除砷的毒性。.通过分子克隆技术获得了无机砷甲基化关键基因GSTΩ两种亚型基因（GSTΩ1和GSTΩ2）序列，通过体外重组表达获其重组蛋白，发现其在低pH和常温下具有较高的活性，而且其活性随着底物As(V)浓度的增大而升高；转化菲律宾蛤仔GSTΩ基因能够显著提高砷超敏感菌株大肠杆菌AW3110对As(III)的耐受力，以上结果表明GSTΩ在对无机砷的转化和解毒方面发挥了重要作用。.免疫组化分析表明GSTΩ主要在鳃和肝消化腔上皮细胞中表达，其中GSTΩ1表达量高于GSTΩ2。受到无机砷胁迫后，菲律宾蛤仔鳃和肝组织GSTΩ在mRNA和蛋白水平上的表达量均表现出显著的上调趋势，GSTΩ活性也明显升高。此外，菲律宾蛤仔还可通过提高组织内GR活性增加GSH含量，从而保证GSTΩ发挥其对无机砷的转化和解毒功能。.本项目研究结果可为海洋软体动物砷生物转化机制的阐明奠定重要基础，亦可为我国海水水质标准的制定以及海产品潜在健康风险的评估提供科学依据。.