氨氮污染对菲律宾蛤仔鳃组织线粒体的损伤机制研究

In recent years, ammonia nitrogen pollution has been a serious threat to the development of mollusk aquaculture. In our previous studies, ammonia nitrogen was found to heavily disturb the membrane stability, energy metabolism, contents of neurotransmitters, signal transduction of calcium ion, redox balance, and so on. According to the literatures and our studies, it is regarded that these toxic effects of ammonia nitrogen on the gill tissues of Ruditapes philippinarum are closely related to mitochondria dysfunction and oxidative damage contributes fundamentally to it. In order to prove the opinion, we will start with the structure and function of mitochondria to investigate the damage effects on the major functions of mitochondria caused by ammonia nitrogen exposure. The selected functions include oxidative damage, oxidative phosphorylation, calcium ion signal transduction and apoptosis. In addition, proteomics will be used to detect differentially expressed proteins after ammonia nitrogen exposure. After bioinformatics analysis, these proteins will be categorized and constructed into a responding map according to the different functions performed by mitochondria to illustrate the toxicological mechanisms of ammonia nitrogen on gill mitochondria at protein level. During the mechanism study, functional biomarkers and protein biomarker of mitochondria will be screened and used as a combinational biomarker which might be detected after the clams are transplanted into a heavy pollution environment with ammonia for a certain period. The responding profiles of the combinational biomarker will be analyzed according to the real content of ammonia nitrogen, which is beneficial to the methodology of biological monitoring.

我国近岸海域的氨氮污染已严重制约贝类养殖业的健康发展。申请人前期研究发现氨氮污染严重影响菲律宾蛤仔鳃组织的膜系统、能量代谢、神经系统、Ca2+信号调控、氧化还原系统等，这些毒性效应均与线粒体功能障碍有关。因此，我们认为氨氮暴露能够引起菲律宾蛤仔鳃组织的线粒体损伤，而氧化损伤是诱导其功能发生异常的主要因素。本项目拟从线粒体的结构与主要功能入手，研究氨氮污染对其造成的氧化胁迫，并从氧化磷酸化、Ca2+信号转导和细胞凋亡等方面入手，分别阐释氨氮对线粒体功能的损伤效应；利用蛋白质组学技术，分析线粒体差异表达蛋白质并进行生物信息学分析，构建差异蛋白在线粒体重要功能方面的响应图谱，筛选其蛋白质生物标志物，从蛋白质水平阐明氨氮对菲律宾蛤仔鳃组织线粒体的毒性作用机理；采用菲律宾蛤仔移植技术，利用组合生物标志物，研究其生物监测的可用性，为氨氮污染的环境评估提供方法学参考。

无机氮是我国近海长期存在的污染物，氨氮是其中毒性最为强烈的一种化合物。前期研究发现线粒体是氨氮毒性攻击的主要细胞器之一，但是其致毒机制还不清楚。本项目以菲律宾蛤仔的鳃组织线粒体为研究对象，以环境相关浓度氨氮对其暴露，从线粒体的结构与主要功能入手，利用透射电镜观察的方法，发现氨氮暴露导致菲律宾蛤仔线粒体的形态发生变化，包括线粒体数目明显减少，空泡增多，嵴的长度缩短及数量消减，部分线粒体边界不清晰，外膜消失，线粒体肿胀厉害，在线粒体周围出现一些自噬体及众多染色较深的异质物。氨氮暴露导致线粒体的关键物质发生变化，例如线粒体DNA拷贝数减少、膜电位剧烈下降、钙离子浓度下降。高浓度和长期氨氮暴露能够加剧其结构损伤及肿胀程度。氨氮暴露导致线粒体功能受损，ATP含量显著下降，TCA循环关键酶类的活性出现显著性变化。氨氮暴露导致蛤仔鳃细胞受到氧化损伤，不过氧化还原酶类对氨氮暴露的反应时段较短，限于急性暴露。氨氮暴露导致蛤仔鳃组织出现明显的细胞凋亡，Caspase-3活性显著上升，抑制凋亡的Bcl-2基因及参与Ca2+迁移相关的基因表达显著增加，影响Ca2+所参与的关键细胞过程，导致线粒体肿胀、细胞凋亡或者坏死、能量代谢、肿瘤或者癌症的形成等。蛋白质组分析发现，线粒体含卟啉化合物的表达减少，β淀粉样蛋白和铁蛋白含量增加，会使蛤仔缺乏对肿瘤形成的抵抗力，并出现阿尔茨海默症；随着暴露时间的延长，嘌呤代谢、鞘脂信号通路蛋白受到显著影响，从而影响蛤仔能量供应、代谢调节、辅酶组成、神经信号传递等。野外实验发现，养殖废水同样能够导致蛤仔能量代谢指标显著变化，但是氧化损伤和凋亡相关指标变化趋势不同。深入研究发现，亚硝氮的存在对氨氮的毒性表现有很大影响，ACP和AKP可以作为其联合暴露毒性指标。